目的構(gòu)建DPC4基因重組質(zhì)粒以研究DPC4對人胰腺癌細胞的抑制作用。方法應(yīng)用RTPCR技術(shù)擴增出野生型DPC4基因全長cDNA，然后用分子克隆技術(shù)構(gòu)建其真核表達載體，應(yīng)用脂質(zhì)體法將DPC4基因?qū)氲饺艘认侔㏄C3細胞中，經(jīng)G418篩選獲得可穩(wěn)定表達DPC4的人胰腺癌細胞，觀察DPC4基因?qū)θ艘认侔┘毎芷诤图毎鲋车挠绊憽＝Y(jié)果獲得了野生型DPC4真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1DPC4，野生型DPC4的導(dǎo)入可引起胰腺癌G1期細胞的增加和S期細胞相應(yīng)減少，同時抑制細胞生長。結(jié)論野生型DPC4基因具有調(diào)節(jié)胰腺癌細胞增殖的功能，可作為胰腺癌基因治療的靶基因。
目的 研究角蛋白17（keratin 17，K-17）對血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和管樣結(jié)構(gòu)形成的影響，了解K-17 在血管生成過程中的作用。 方法 將人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）于含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法向HUVEC 中分別加入K-17- 小分子干擾RNA（small interferingRNA，siRNA）- 轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 2000）混合液（實驗組）、siRNA- 轉(zhuǎn)染試劑混合液（陰性對照組），使siRNA 終濃度為50 nmol/L；對照組加相同體積僅含載體（脂質(zhì)體Lipofectamine 2000）的培養(yǎng)基，采用RT-PCR 和Western blot 法檢測K-17-siRNA 沉默效果。于培養(yǎng)后36 h 采用細胞計數(shù)法檢測細胞增殖能力；培養(yǎng)后30 h，分別采用24 孔板Millicell小室檢測細胞遷移能力以及膠原纖維凝膠實驗法檢測細胞分化成管能力。另取未經(jīng)siRNA 處理的HUVEC 分別在含10%FBS 的培養(yǎng)基（A 組）、含2%FBS 的培養(yǎng)基（B 組）和含2%FBS 及10 ng/mL bFGF 的培養(yǎng)基（C 組）中培養(yǎng)24 h，檢測HUVEC K-17 的表達。 結(jié)果 實驗組K-17-siRNA 作用于HUVEC 30 h 后，RT-PCR 檢測示細胞內(nèi)K-17 mRNA 的表達為0.09 ± 0.01，較陰性對照組0.35 ± 0.07 和對照組0.34 ± 0.06 均降低了約74%（P lt; 0.01）；Western blot 檢測示實驗組K-17-siRNA 作用于HUVEC 30 h 后，細胞內(nèi)K-17 蛋白表達為0.19 ± 0.01，較陰性對照組0.52 ± 0.01 和對照組0.55 ± 0.02分別降低了63% 和65%（P lt; 0.01）；陰性對照組和對照組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。K-17-siRNA 作用HUVEC 36 h 后，實驗組細胞增殖能力與陰性對照組和對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。HUVEC 轉(zhuǎn)染K-17-siRNA 30 h 后，實驗組HUVEC 24 h 穿過Millicell 小室上室膜進入下室的細胞數(shù)為（3 719.0 ± 319.0）個，明顯低于陰性對照組（7 356.3 ± 795.7）個和對照組（7 437.5 ± 212.0）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01），陰性對照組和對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。實驗組、陰性對照組和對照組HUVEC 24 h 分化形成的管數(shù)分別為（1.1 ± 0.5）、（3.6 ± 0.5）和（3.2 ±0.6）管/ 視野，實驗組與陰性對照組、對照組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01），陰性對照組和對照組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。A、B、C 組HUVEC K-17 的表達分別為0.25 ± 0.02、0.08 ± 0.01 和0.72 ± 0.03，3 組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）。 結(jié)論 K-17 對HUVEC 增殖無影響，但增強其遷移能力，有利于血管生成。