目的 評價HAP 涂層鎳鈦記憶合金的組織相容性，為其在骨缺損修復(fù)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方 法 取24 只青紫蘭兔，體重2.0 ～ 2.5 kg，隨機分為實驗組和對照組，每組12 只。行左側(cè)股外側(cè)切口，分離顯露股骨后，選取股骨下1/3 處手術(shù)鉆孔作為種植區(qū)，實驗組植入HAP 涂層鎳鈦記憶合金，對照組不植入材料。大腿后外側(cè)肌肉覆蓋缺損區(qū)。分別于術(shù)后7、14、28、56 d 每組各處死3 只動物，取材行大體觀察、組織學觀察、BMP-2 免疫組織化學染色觀察及圖像灰度值分析，組織學觀察結(jié)果按照中華人民共和國國家標準GB/T16886.6-1997 從炎癥、纖維組織囊壁形成、材料降解及周邊組織反應(yīng)4 個方面進行組織學評價。 結(jié)果 所有兔均存活至取材，兩組植入物完全包埋于骨組織內(nèi)部，無松動，無明顯骨吸收現(xiàn)象。材料植入后7 d，兩組炎性細胞浸潤和纖維增生最明顯，纖維組織囊壁形成，植入材料呈大片狀被囊壁包裹；術(shù)后56 d，實驗組部分標本囊壁結(jié)締組織增生反應(yīng)仍較明顯，劣于對照組，但分級符合GB/T16886.6-1997 體內(nèi)植入標準。免疫組織化學染色示內(nèi)源性BMP-2 定位于多能MSCs、成骨細胞的胞質(zhì)內(nèi)；兩組圖像分析結(jié)果顯示，BMP-2隨骨缺損的修復(fù)過程呈階段性分泌，兩組BMP-2 在術(shù)后14 d 時表達最高，以后逐漸降低。BMP-2 在各時間點染色灰度值比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 HAP 涂層鎳鈦記憶合金作為生物醫(yī)學材料具有良好的骨組織相容性。
目的 探討CPC 作為rhBMP-2 載體促進家兔脊柱融合的作用及效果。 方法 取1 mg rhBMP-2分別與1 g CPC、體積為6.0 cm × 2.0 cm × 0.5 cm 的醫(yī)用明膠海綿（absorbable gelatin sponge，AGS）吸附復(fù)合，凍干制備rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/AGS 生物材料。45 只24 周齡新西蘭兔，體重2.5 ～ 3.5 kg，隨機分為A（n=17）、B（n=11）、C（n=17）3 組。暴露L5、6 橫突，將L5、6 橫突后緣骨皮質(zhì)磨除，露出松質(zhì)骨，行后路雙側(cè)L5、6 橫突間植骨，A、B、C 組分別植入rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/AGS、CPC 3 種材料。于術(shù)后4、8、24 周，行大體、組織學觀察及影像學檢查。 結(jié)果 術(shù)后4、8周脫鈣組織切片，A 組均見明顯骨痂連接；B 組僅見小片骨痂；C 組見纖維連接，局部少許軟骨。術(shù)后4 周A、B、C 組脫鈣組織切片評分分別為（7.30 ± 0.76）、（3.68 ± 1.60）和（1.75 ± 0.54）分，術(shù)后8 周分別為（8.32 ± 1.11）、（3.75 ± 1.23）和（1.47 ±0.23）分；各時間點A、B 組以及A、C 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。不脫鈣硬組織切片術(shù)后4、8 周A 組均見類松質(zhì)骨樣骨組織再生，C 組植入物周圍見纖維連接，少許成骨。術(shù)后4 周單位面積內(nèi)成骨面積A、C 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）； 術(shù)后8 周，A、C 組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。三維重建CT 評分A、B、C 組分別為（2.50 ±0.57）、（1.00 ± 0.00）和（1.00 ± 0.00）分，C 組與A、B 組以及A、B 組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié) 論 CPC作為rhBMP-2 載體能夠促進家兔脊柱骨性融合，可作為一種新型的人工骨修復(fù)材料。
目的 探討負載rhBMP-2 的CPC 活性人工骨修復(fù)骨缺損的臨床應(yīng)用，評價其臨床使用效果和安全性。 方法 2006 年6 月－ 2007 年9 月，采用負載rhBMP-2 的CPC（rhBMP-2/CPC 組）和單純CPC（對照組）修復(fù)骨缺損112 例，骨缺損范圍為1 cm × 1 cm × 1 cm～ 4 cm × 3 cm × 3 cm。其中對照組63 例，男31 例，女32 例；年齡17 ～ 70 歲，平均47.4 歲。骨缺損部位：跟骨19 例，脛骨平臺20 例，肱骨近端8 例，橈骨遠端9 例，胸腰椎7 例。rhBMP-2/CPC 組49 例，男31 例，女18 例；年齡16 ～ 68 歲，平均45.6 歲。骨缺損部位：跟骨11 例，脛骨平臺16 例，肱骨近端7 例，橈骨遠端2 例，脛骨遠端2 例，胸腰椎11 例。術(shù)中采用負載rhBMP-2/CPC（2 ～ 5 g）或單純CPC（2 ～ 50 g）填充骨缺損。 結(jié)果 術(shù)后108 例傷口Ⅰ期愈合；術(shù)后2 周對照組1 例及rhBMP-2/CPC 組3 例傷口有淡黃色清亮稀薄分泌物滲出，經(jīng)換藥及激素治療后愈合。所有患者未見毒性反應(yīng)，無皮疹或高熱，肝腎功能、血、尿常規(guī)及C 反應(yīng)蛋白均正常。112 例均獲隨訪，隨訪時間12 ～ 24 個月，平均13.2 個月。隨訪期間未發(fā)生骨髓炎，無再骨折，無明顯骨缺損修復(fù)后再塌陷，無鋼板及螺釘松動、斷裂等并發(fā)癥，脊柱手術(shù)的椎體前緣無高度不足發(fā)生。兩組術(shù)后3 個月骨折均達骨性愈合，無延遲愈合或骨不連發(fā)生?；贾顒忧闆r良好，屈伸功能達正常活動水平。 結(jié)論 負載rhBMP-2 的CPC 活性人工骨修復(fù)骨缺損安全、有效，是一種理想的骨缺損修復(fù)材料。
目的 探討NGF 對骨折愈合的影響，以及對BMP-2 誘導(dǎo)成骨的作用。 方法 清潔級雄性6 ～ 8 周昆明小鼠60 只，體重23 ～ 25 g，隨機分為4 組，每組15 只。建立股骨中段不穩(wěn)定軟骨內(nèi)成骨骨折模型，A、B、C、D 組分別于骨折斷端局部使用NGF/ 生理鹽水、BMP-2、BMP-2/NGF/ 生理鹽水、生理鹽水。各組分別于術(shù)后14、21 和28 d 各處死5 只小鼠，并于骨折部位取材行大體、X 線片觀察、生化檢測及組織學觀察。處死小鼠前取小鼠眼球球后動靜脈血液行血清ALP 活性測定。 結(jié)果 術(shù)后各時間點，大體觀察A、B、C 組局部新生硬組織大小、硬度，骨折斷端骨痂生長依次增加，均高于D 組。X 線片觀察A、B、C 組骨折線逐漸模糊，鈣化面積依次增大，均快于D 組。組織學觀察A、B、C 組骨小梁成熟度依次增加，均優(yōu)于D 組。術(shù)后各時間點，A、B、C 組成骨面積和成骨區(qū)灰度值、血清ALP 含量、骨痂組織中ALP含量和鈣含量、骨痂濕重均高于D 組。術(shù)后各時間點各組成骨面積和成骨區(qū)灰度值比較、術(shù)后14 d 各組血清中ALP 含量比較、術(shù)后14 d 和21 d 各組骨痂組織中ALP 含量比較、術(shù)后21 d 和28 d 各組骨痂組織中鈣含量及骨痂濕重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。術(shù)后14 d，B、C 組與A、D 組比較骨痂濕重差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。術(shù)后21、28 d，骨組織形態(tài)計量分析顯示各組新生骨骨小梁表面成骨細胞指數(shù)、平均骨小梁面積百分比和平均骨小梁寬度隨時間增大依次減小，A、B、C 組依次增大，均高于D 組，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 NGF 有促進骨折愈合作用，且具有協(xié)同BMP-2 誘導(dǎo)成骨的作用。
目的 探討重組質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165 體外轉(zhuǎn)染對hBMSCs 成骨誘導(dǎo)分化的影響。 方 法 構(gòu)建hBMP-2 和hVEGF165 真核共表達載體。取健康成人自愿捐獻的骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，采用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165 和空質(zhì)粒載體（pIRES-neo）轉(zhuǎn)染至hBMSCs，作為A、B、C、D 組；另取相同數(shù)量的未轉(zhuǎn)染細胞作為對照組（E 組）。培養(yǎng)4 周，采用RT-PCR 檢測hBMP-2、hVEGF165 以及骨鈣mRNA 表達，Western blot 檢測細胞 hBMP-2 和 hVEGF165 表達，定量檢測ALP 活性，免疫組織化學方法檢測Col Ⅰ表達。 結(jié) 果 與E 組比較，A 組hBMSCs 高表達hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨鈣素，B 組大量表達骨鈣素及Col Ⅰ，C組高表達hVEGF165，而B 組hVEGF165 及C 組hBMP-2 和Col Ⅰ的表達與D、E 組相似，呈陰性或僅有痕量表達。A、B、C、D 及E 組ALP 活性分別為0.91 ± 0.03、0.90 ± 0.02、0.64 ± 0.03、0.67 ± 0.01、0.66 ± 0.02，A、B 組與E 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05），C、D、E 組差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 重組質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體能成功轉(zhuǎn)染hBMSCs，外源性hBMP-2 和 hVEGF165 基因在轉(zhuǎn)染細胞中能持續(xù)表達，并能增強hBMSCs 的成骨能力。
【摘 要】 目的 以PLGA 和膠原海綿為載體，分別復(fù)合rhBMP-2，比較兩者修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。 方法 將PLGA和膠原海綿制成直徑4 mm、厚3 mm的圓柱形，分別與0.5 mg rhBMP-2 復(fù)合。2 月齡新西蘭兔24 只，雌雄不拘，體重1.8 ～ 2.3 kg，平均2.0 kg。于24 只兔雙側(cè)股骨髁部制造直徑4 mm 的缺損，其中18 只動物右側(cè)缺損處植入PLGA/rhBMP-2 復(fù)合物（實驗1 組），左側(cè)缺損處植入膠原海綿/rhBMP-2 復(fù)合物（實驗2 組） ；余6 只動物（12 個膝關(guān)節(jié)）缺損不作任何處理，作為空白對照組。術(shù)后4、12 和24 周取材，行大體及組織學觀察，并根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨半定量評分標準進行組織學評分。 結(jié)果 大體及組織學觀察：4 周，實驗1 組缺損內(nèi)被半透明組織填充；實驗2 組缺損未被新生組織填滿，兩組形成的軟骨組織與周圍界限明顯, 軟骨細胞分布較均一，排列無方向性；對照組中形成少量纖維組織。12 周，實驗1 組缺損內(nèi)完全充填白色半透明新生軟骨組織，與正常軟骨界限不清；實驗2 組缺損內(nèi)形成白色半透明軟骨組織，與周圍正常軟骨界限仍可辨認；兩組新生軟骨厚度逐漸接近正常軟骨厚度，表面細胞平行排列，深層細胞排列較紊亂，基質(zhì)異染，軟骨下骨及潮線恢復(fù)，與正常軟骨連接良好；對照組缺損邊緣及底部形成少量軟骨細胞，分布不均勻，底部纖維組織不連續(xù)。24 周，實驗1 組缺損內(nèi)形成半透明新生軟骨組織，與正常軟骨界限消失；實驗2 組形成的新生軟骨組織顏色、質(zhì)地與12 周接近；兩組新生軟骨與正常軟骨厚度相近，表面平整，細胞排列均一，但較紊亂，基質(zhì)異染，軟骨下骨及潮線恢復(fù)，與正常軟骨連接良好；對照組缺損底部形成一層纖維組織，不連續(xù)。組織學評分：實驗1 組、實驗2 組與對照組在各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；兩個實驗組12、24 周與4 周比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01），但12 周和24 周比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；同一時間點兩實驗組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 PLGA 和膠原海綿與rhBMP-2 復(fù)合均可修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。
【摘 要】 目的 探討B(tài)MP-2 與膠原復(fù)合材料在骨骼肌中異位成骨預(yù)構(gòu)骨肌皮瓣，修復(fù)自體下頜骨和皮膚復(fù)合缺損的可行性。 方法 4 ～ 6 周齡新西蘭白兔24 只，體重2.0 ～ 2.5 kg，雌雄不拘，隨機分成3 組，即實驗組、對照組和空白組（n=8）。將BMP-2 與膠原復(fù)合，植入兔背闊肌，預(yù)構(gòu)異位新生骨組織，2、4、6 周后行X 線片、ALP、Von Kossa、CD31 免疫組織化學血管標記及組織學觀察。6 周后，實驗組動物于同側(cè)下頜骨體部制備2 cm × 3 cm 皮膚缺損，并形成直徑8 mm 洞穿性骨缺損；以同側(cè)胸背動脈體表投影為皮瓣縱軸，設(shè)計含預(yù)制新骨組織的背闊肌肌皮瓣，帶蒂移位修復(fù)下頜骨及皮膚復(fù)合缺損。對照組和空白組實驗動物下頜骨體部均造成直徑8 mm 的洞穿性骨缺損，對照組將復(fù)合組織瓣中的骨性部分游離移植修復(fù)缺損；空白組缺損不予修復(fù)。術(shù)后6 周，各組取材行四環(huán)素熒光染色、X 線攝片、組織學觀察以及新骨計量等，觀察骨和皮膚復(fù)合缺損修復(fù)效果。 結(jié)果 BMP-2 與膠原復(fù)合材料在兔背闊肌中4 ～ 6 周成骨，膠原材料于植入后3 ～ 5 周降解，成骨過程以軟骨成骨為主，新骨形態(tài)為編織骨，可見明顯的微血管分布。修復(fù)自體下頜骨缺損6 周后，實驗組皮膚及骨缺損均愈合良好，對照組缺損修復(fù)區(qū)基本骨化，空白組尚殘留大塊骨缺損；實驗組、對照組及空白組新骨計量分別為（1.594 ± 0.674）、（0.801 ± 0.036）和（0.079 ± 0.010）mm2，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié) 論 預(yù)構(gòu)的骨肌皮瓣帶血管蒂移位修復(fù)兔自體下頜骨和皮膚復(fù)合缺損具有可行性和明顯優(yōu)勢，有望成為一種血管化骨移植的供區(qū)預(yù)構(gòu)形式。
【摘 要】 目的 評價HA 復(fù)合rhBMP-2 的腺病毒（adenovirus mediated rhBMP-2，Adv-rhBMP-2）轉(zhuǎn)染的羊BMSCs 對骨痂延長骨愈合的影響。 方法 成年山羊19 只，雌雄不限，體重15 ～ 20 kg。于每只羊髂嵴上穿刺抽取骨髓10 mL，常規(guī)傳代培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs，以感染復(fù)數(shù)200 轉(zhuǎn)染腺病毒。取0.25% 胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后3 d 的細胞1 ×108 個，與HA 充分混勻制備Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA。建立山羊右側(cè)脛骨延長模型，術(shù)后立即于截骨部位注射自體細胞復(fù)合物。按術(shù)后注入物質(zhì)不同隨機分成4 組：A 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA 組（n=6），B 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs 組（n=5），C 組為Adv-β-gal/BMSCs/HA 組（n=4），D 組為空白組（n=4）。術(shù)后第7 天開始行脛骨延長，速度1 mm/d，共延長4 周。術(shù)后5、8、12 周攝X 線片觀察骨痂生長情況，12 周處死動物，取標本分別行骨密度檢測、生物力學測定、組織學觀察和骨形態(tài)計量學分析。 結(jié)果 X 線片檢查示，術(shù)后5、8 周A、B 組骨痂生成量明顯多于C、D 組，X 線片定量評分A、B 組明顯高于C、D 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；12 周各組均在骨延長部位形成連續(xù)骨痂。骨密度測定：術(shù)后12 周A、B、C、D 組延長部位骨礦物質(zhì)含量分別為（4.175 ± 1.921）、（2.600 ± 0.638）、（2.425 ± 0.826）和（1.175 ± 0.574） g，骨礦物質(zhì)密度分別為（0.612 ± 0.196）、（0.630 ± 0.159）、（0.450 ± 0.166）和（0.266 ± 0.113）g/cm2，A、B 組顯著高于C、D組（P lt; 0.05）。生物力學測定：A、B、C、D 組最大載荷分別為（490.20 ± 155.08）、（350.59 ± 80.48）、（221.95 ± 68.79）和（150.65 ± 92.29）N，彈性模量為（178.24 ± 105.80）、（105.88 ± 27.09）、（81.18 ± 48.67）和（50.35 ± 47.64）MPa，各指標A組顯著高于C、D 組（P lt; 0.05）。組織學觀察見A 組骨延長處大量新生骨組織，骨小梁多為縱行網(wǎng)狀排列。骨形態(tài)計量分析示A、B、C、D 組新骨體積分別為72.35% ± 5.68%、67.58% ± 7.42%、49.63% ± 4.87% 和38.87% ± 2.35%，A 組新生骨生成量明顯比D 組多（P lt; 0.05）。 結(jié)論 HA 復(fù)合rhBMP-2 修飾的BMSCs 制備的組織工程骨可促進羊脛骨延長骨愈合。
【摘 要】 目的 研究以聚-DL- 乳酸（poly-D,L-lactic acid，PDLLA）為載體復(fù)合rhBMP-2 接骨板的制備，并觀察其生物相容性，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法 將rhBMP-2 以0.05 mg/ 板與PDLLA 真空負壓抽吸復(fù)合，制備復(fù)合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板。新西蘭大白兔32 只，雌雄不限，體重（3.0 ± 0.5） kg。制備雙側(cè)尺骨中段2.5 mm 骨及骨膜缺損模型。取右側(cè)為實驗組（n=32），采用復(fù)合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板固定尺骨骨折處；左側(cè)為對照組（n=32），采用普通PDLLA 接骨板固定。于術(shù)后2、4、8 和12 周行大體、X 線片和組織學觀察，比較復(fù)合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板與普通PDLLA 接骨板的生物相容性。 結(jié)果 復(fù)合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板孔隙率為90%，孔徑150 μm，拉伸強度gt; 50 MPa，三點抗彎強度gt; 90 MPa，特性黏度1.6 dL/g（氯仿溶劑）。動物切口均于1 ～ 2 周Ⅰ期愈合，動物飲食及活動恢復(fù)正常，無肢體活動受限及跛行。兩種接骨板均固定牢固，骨折端無移位，材料逐步降解，實驗組接骨板降解較對照組快。X 線片：實驗組術(shù)后2、4、8 及12 周骨折修復(fù)的X 線阻射密度值分別為39.22 ± 2.48、48.79 ± 1.26、63.78 ± 1.78 及78.60 ± 1.25；對照組分別為33.83 ± 1.13、41.28 ± 1.25、55.23 ± 0.68 及66.54 ± 1.33，兩組各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。組織學觀察，實驗組接骨板與周圍組織的相容性、成骨速度、骨再生量、再生髓腔結(jié)構(gòu)等方面均優(yōu)于對照組；實驗組術(shù)后2、4、8 及12 周骨缺損區(qū)新骨形成面積百分比分別為0.106% ± 0.015%、0.292% ± 0.019%、0.457% ± 0.048%及0.601% ± 0.037%；對照組分別為0、0.193% ± 0.019%、0.339% ± 0.029% 及0.574% ± 0.047%；不同時間點兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 復(fù)合 rhBMP-2 的PDLLA 接骨板生物相容性良好，較之普通PDLLA 接骨板具有更良好骨誘導(dǎo)性和骨折修復(fù)能力。
【摘 要】 目的 通過引入內(nèi)部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site，IRES），構(gòu)建帶有hVEGF165 及hBMP-7 雙基因的重組腺相關(guān)病毒載體（adeno-associated virus，AAV），并對其進行鑒定。 方法 以AAV 腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)（helper-free system）為基礎(chǔ)，將真核表達質(zhì)粒pIRES 中的IRES 片段定向克隆至腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAVMCS中，形成含有IRES 序列及上、下游多克隆位點的重組骨架質(zhì)粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR 擴增hVEGF165 和hBMP-7 基因，先后亞克隆入重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒IRES 序列上、下游的多克隆位點，獲得重組質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。將其和包裝質(zhì)粒pAAV-RC、輔助質(zhì)粒pHelper 三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293 細胞，包裝重組腺相關(guān)病毒rAAVhVEGF165-IRES-hBMP-7，同時包裝含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的重組病毒rAAV-IRES-GFP作平行對照。熒光顯微鏡下監(jiān)測病毒包裝效率，收獲重組病毒后感染AAV-HT1080 細胞測定病毒滴度，并通過病毒基因組外源基因擴增鑒定重組病毒的包裝是否成功。 結(jié)果 重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 經(jīng)雙酶切鑒定正確。熒光顯微鏡下觀察三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293 細胞72 h 后，病毒包裝效率達95% ～ 100%，收獲的重組病毒具有較高濃度及活性，感染AAV-HT1080 效率達90%，熒光計數(shù)法測定病毒感染滴度達5.5 × 1011 vp/mL。提取重組病毒基因組成功擴增出外源目的基因hVEGF165 及hBMP-7 片段，重組病毒包裝成功。 結(jié)論 成功構(gòu)建帶有hVEGF165 及hBMP-7 雙基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7，收獲的病毒具有較高滴度，為今后利用腺相關(guān)病毒載體進行hVEGF165 及hBMP-7 雙基因共表達影響骨修復(fù)的體外及體內(nèi)研究提供實驗基礎(chǔ)。