目的 評價HAP 涂層鎳鈦記憶合金的組織相容性，為其在骨缺損修復的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方 法 取24 只青紫蘭兔，體重2.0 ～ 2.5 kg，隨機分為實驗組和對照組，每組12 只。行左側(cè)股外側(cè)切口，分離顯露股骨后，選取股骨下1/3 處手術(shù)鉆孔作為種植區(qū)，實驗組植入HAP 涂層鎳鈦記憶合金，對照組不植入材料。大腿后外側(cè)肌肉覆蓋缺損區(qū)。分別于術(shù)后7、14、28、56 d 每組各處死3 只動物，取材行大體觀察、組織學觀察、BMP-2 免疫組織化學染色觀察及圖像灰度值分析，組織學觀察結(jié)果按照中華人民共和國國家標準GB/T16886.6-1997 從炎癥、纖維組織囊壁形成、材料降解及周邊組織反應(yīng)4 個方面進行組織學評價。 結(jié)果 所有兔均存活至取材，兩組植入物完全包埋于骨組織內(nèi)部，無松動，無明顯骨吸收現(xiàn)象。材料植入后7 d，兩組炎性細胞浸潤和纖維增生最明顯，纖維組織囊壁形成，植入材料呈大片狀被囊壁包裹；術(shù)后56 d，實驗組部分標本囊壁結(jié)締組織增生反應(yīng)仍較明顯，劣于對照組，但分級符合GB/T16886.6-1997 體內(nèi)植入標準。免疫組織化學染色示內(nèi)源性BMP-2 定位于多能MSCs、成骨細胞的胞質(zhì)內(nèi)；兩組圖像分析結(jié)果顯示，BMP-2隨骨缺損的修復過程呈階段性分泌，兩組BMP-2 在術(shù)后14 d 時表達最高，以后逐漸降低。BMP-2 在各時間點染色灰度值比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 HAP 涂層鎳鈦記憶合金作為生物醫(yī)學材料具有良好的骨組織相容性。
目的 探討CPC 作為rhBMP-2 載體促進家兔脊柱融合的作用及效果。 方法 取1 mg rhBMP-2分別與1 g CPC、體積為6.0 cm × 2.0 cm × 0.5 cm 的醫(yī)用明膠海綿（absorbable gelatin sponge，AGS）吸附復合，凍干制備rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/AGS 生物材料。45 只24 周齡新西蘭兔，體重2.5 ～ 3.5 kg，隨機分為A（n=17）、B（n=11）、C（n=17）3 組。暴露L5、6 橫突，將L5、6 橫突后緣骨皮質(zhì)磨除，露出松質(zhì)骨，行后路雙側(cè)L5、6 橫突間植骨，A、B、C 組分別植入rhBMP-2/CPC、rhBMP-2/AGS、CPC 3 種材料。于術(shù)后4、8、24 周，行大體、組織學觀察及影像學檢查。 結(jié)果 術(shù)后4、8周脫鈣組織切片，A 組均見明顯骨痂連接；B 組僅見小片骨痂；C 組見纖維連接，局部少許軟骨。術(shù)后4 周A、B、C 組脫鈣組織切片評分分別為（7.30 ± 0.76）、（3.68 ± 1.60）和（1.75 ± 0.54）分，術(shù)后8 周分別為（8.32 ± 1.11）、（3.75 ± 1.23）和（1.47 ±0.23）分；各時間點A、B 組以及A、C 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。不脫鈣硬組織切片術(shù)后4、8 周A 組均見類松質(zhì)骨樣骨組織再生，C 組植入物周圍見纖維連接，少許成骨。術(shù)后4 周單位面積內(nèi)成骨面積A、C 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）； 術(shù)后8 周，A、C 組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。三維重建CT 評分A、B、C 組分別為（2.50 ±0.57）、（1.00 ± 0.00）和（1.00 ± 0.00）分，C 組與A、B 組以及A、B 組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié) 論 CPC作為rhBMP-2 載體能夠促進家兔脊柱骨性融合，可作為一種新型的人工骨修復材料。
目的 探討負載rhBMP-2 的CPC 活性人工骨修復骨缺損的臨床應(yīng)用，評價其臨床使用效果和安全性。 方法 2006 年6 月－ 2007 年9 月，采用負載rhBMP-2 的CPC（rhBMP-2/CPC 組）和單純CPC（對照組）修復骨缺損112 例，骨缺損范圍為1 cm × 1 cm × 1 cm～ 4 cm × 3 cm × 3 cm。其中對照組63 例，男31 例，女32 例；年齡17 ～ 70 歲，平均47.4 歲。骨缺損部位：跟骨19 例，脛骨平臺20 例，肱骨近端8 例，橈骨遠端9 例，胸腰椎7 例。rhBMP-2/CPC 組49 例，男31 例，女18 例；年齡16 ～ 68 歲，平均45.6 歲。骨缺損部位：跟骨11 例，脛骨平臺16 例，肱骨近端7 例，橈骨遠端2 例，脛骨遠端2 例，胸腰椎11 例。術(shù)中采用負載rhBMP-2/CPC（2 ～ 5 g）或單純CPC（2 ～ 50 g）填充骨缺損。 結(jié)果 術(shù)后108 例傷口Ⅰ期愈合；術(shù)后2 周對照組1 例及rhBMP-2/CPC 組3 例傷口有淡黃色清亮稀薄分泌物滲出，經(jīng)換藥及激素治療后愈合。所有患者未見毒性反應(yīng)，無皮疹或高熱，肝腎功能、血、尿常規(guī)及C 反應(yīng)蛋白均正常。112 例均獲隨訪，隨訪時間12 ～ 24 個月，平均13.2 個月。隨訪期間未發(fā)生骨髓炎，無再骨折，無明顯骨缺損修復后再塌陷，無鋼板及螺釘松動、斷裂等并發(fā)癥，脊柱手術(shù)的椎體前緣無高度不足發(fā)生。兩組術(shù)后3 個月骨折均達骨性愈合，無延遲愈合或骨不連發(fā)生。患肢活動情況良好，屈伸功能達正常活動水平。 結(jié)論 負載rhBMP-2 的CPC 活性人工骨修復骨缺損安全、有效，是一種理想的骨缺損修復材料。
目的 探討NGF 對骨折愈合的影響，以及對BMP-2 誘導成骨的作用。 方法 清潔級雄性6 ～ 8 周昆明小鼠60 只，體重23 ～ 25 g，隨機分為4 組，每組15 只。建立股骨中段不穩(wěn)定軟骨內(nèi)成骨骨折模型，A、B、C、D 組分別于骨折斷端局部使用NGF/ 生理鹽水、BMP-2、BMP-2/NGF/ 生理鹽水、生理鹽水。各組分別于術(shù)后14、21 和28 d 各處死5 只小鼠，并于骨折部位取材行大體、X 線片觀察、生化檢測及組織學觀察。處死小鼠前取小鼠眼球球后動靜脈血液行血清ALP 活性測定。 結(jié)果 術(shù)后各時間點，大體觀察A、B、C 組局部新生硬組織大小、硬度，骨折斷端骨痂生長依次增加，均高于D 組。X 線片觀察A、B、C 組骨折線逐漸模糊，鈣化面積依次增大，均快于D 組。組織學觀察A、B、C 組骨小梁成熟度依次增加，均優(yōu)于D 組。術(shù)后各時間點，A、B、C 組成骨面積和成骨區(qū)灰度值、血清ALP 含量、骨痂組織中ALP含量和鈣含量、骨痂濕重均高于D 組。術(shù)后各時間點各組成骨面積和成骨區(qū)灰度值比較、術(shù)后14 d 各組血清中ALP 含量比較、術(shù)后14 d 和21 d 各組骨痂組織中ALP 含量比較、術(shù)后21 d 和28 d 各組骨痂組織中鈣含量及骨痂濕重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。術(shù)后14 d，B、C 組與A、D 組比較骨痂濕重差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。術(shù)后21、28 d，骨組織形態(tài)計量分析顯示各組新生骨骨小梁表面成骨細胞指數(shù)、平均骨小梁面積百分比和平均骨小梁寬度隨時間增大依次減小，A、B、C 組依次增大，均高于D 組，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 NGF 有促進骨折愈合作用，且具有協(xié)同BMP-2 誘導成骨的作用。
目的 探討重組質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165 體外轉(zhuǎn)染對hBMSCs 成骨誘導分化的影響。 方 法 構(gòu)建hBMP-2 和hVEGF165 真核共表達載體。取健康成人自愿捐獻的骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，采用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165 和空質(zhì)粒載體（pIRES-neo）轉(zhuǎn)染至hBMSCs，作為A、B、C、D 組；另取相同數(shù)量的未轉(zhuǎn)染細胞作為對照組（E 組）。培養(yǎng)4 周，采用RT-PCR 檢測hBMP-2、hVEGF165 以及骨鈣mRNA 表達，Western blot 檢測細胞 hBMP-2 和 hVEGF165 表達，定量檢測ALP 活性，免疫組織化學方法檢測Col Ⅰ表達。 結(jié) 果 與E 組比較，A 組hBMSCs 高表達hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨鈣素，B 組大量表達骨鈣素及Col Ⅰ，C組高表達hVEGF165，而B 組hVEGF165 及C 組hBMP-2 和Col Ⅰ的表達與D、E 組相似，呈陰性或僅有痕量表達。A、B、C、D 及E 組ALP 活性分別為0.91 ± 0.03、0.90 ± 0.02、0.64 ± 0.03、0.67 ± 0.01、0.66 ± 0.02，A、B 組與E 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05），C、D、E 組差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 重組質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體能成功轉(zhuǎn)染hBMSCs，外源性hBMP-2 和 hVEGF165 基因在轉(zhuǎn)染細胞中能持續(xù)表達，并能增強hBMSCs 的成骨能力。
【摘 要】 目的 以PLGA 和膠原海綿為載體，分別復合rhBMP-2，比較兩者修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。 方法 將PLGA和膠原海綿制成直徑4 mm、厚3 mm的圓柱形，分別與0.5 mg rhBMP-2 復合。2 月齡新西蘭兔24 只，雌雄不拘，體重1.8 ～ 2.3 kg，平均2.0 kg。于24 只兔雙側(cè)股骨髁部制造直徑4 mm 的缺損，其中18 只動物右側(cè)缺損處植入PLGA/rhBMP-2 復合物（實驗1 組），左側(cè)缺損處植入膠原海綿/rhBMP-2 復合物（實驗2 組） ；余6 只動物（12 個膝關(guān)節(jié)）缺損不作任何處理，作為空白對照組。術(shù)后4、12 和24 周取材，行大體及組織學觀察，并根據(jù)關(guān)節(jié)軟骨半定量評分標準進行組織學評分。 結(jié)果 大體及組織學觀察：4 周，實驗1 組缺損內(nèi)被半透明組織填充；實驗2 組缺損未被新生組織填滿，兩組形成的軟骨組織與周圍界限明顯, 軟骨細胞分布較均一，排列無方向性；對照組中形成少量纖維組織。12 周，實驗1 組缺損內(nèi)完全充填白色半透明新生軟骨組織，與正常軟骨界限不清；實驗2 組缺損內(nèi)形成白色半透明軟骨組織，與周圍正常軟骨界限仍可辨認；兩組新生軟骨厚度逐漸接近正常軟骨厚度，表面細胞平行排列，深層細胞排列較紊亂，基質(zhì)異染，軟骨下骨及潮線恢復，與正常軟骨連接良好；對照組缺損邊緣及底部形成少量軟骨細胞，分布不均勻，底部纖維組織不連續(xù)。24 周，實驗1 組缺損內(nèi)形成半透明新生軟骨組織，與正常軟骨界限消失；實驗2 組形成的新生軟骨組織顏色、質(zhì)地與12 周接近；兩組新生軟骨與正常軟骨厚度相近，表面平整，細胞排列均一，但較紊亂，基質(zhì)異染，軟骨下骨及潮線恢復，與正常軟骨連接良好；對照組缺損底部形成一層纖維組織，不連續(xù)。組織學評分：實驗1 組、實驗2 組與對照組在各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；兩個實驗組12、24 周與4 周比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01），但12 周和24 周比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）；同一時間點兩實驗組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 PLGA 和膠原海綿與rhBMP-2 復合均可修復關(guān)節(jié)軟骨缺損。
【摘 要】 目的 探討B(tài)MP-2 與膠原復合材料在骨骼肌中異位成骨預構(gòu)骨肌皮瓣，修復自體下頜骨和皮膚復合缺損的可行性。 方法 4 ～ 6 周齡新西蘭白兔24 只，體重2.0 ～ 2.5 kg，雌雄不拘，隨機分成3 組，即實驗組、對照組和空白組（n=8）。將BMP-2 與膠原復合，植入兔背闊肌，預構(gòu)異位新生骨組織，2、4、6 周后行X 線片、ALP、Von Kossa、CD31 免疫組織化學血管標記及組織學觀察。6 周后，實驗組動物于同側(cè)下頜骨體部制備2 cm × 3 cm 皮膚缺損，并形成直徑8 mm 洞穿性骨缺損；以同側(cè)胸背動脈體表投影為皮瓣縱軸，設(shè)計含預制新骨組織的背闊肌肌皮瓣，帶蒂移位修復下頜骨及皮膚復合缺損。對照組和空白組實驗動物下頜骨體部均造成直徑8 mm 的洞穿性骨缺損，對照組將復合組織瓣中的骨性部分游離移植修復缺損；空白組缺損不予修復。術(shù)后6 周，各組取材行四環(huán)素熒光染色、X 線攝片、組織學觀察以及新骨計量等，觀察骨和皮膚復合缺損修復效果。 結(jié)果 BMP-2 與膠原復合材料在兔背闊肌中4 ～ 6 周成骨，膠原材料于植入后3 ～ 5 周降解，成骨過程以軟骨成骨為主，新骨形態(tài)為編織骨，可見明顯的微血管分布。修復自體下頜骨缺損6 周后，實驗組皮膚及骨缺損均愈合良好，對照組缺損修復區(qū)基本骨化，空白組尚殘留大塊骨缺損；實驗組、對照組及空白組新骨計量分別為（1.594 ± 0.674）、（0.801 ± 0.036）和（0.079 ± 0.010）mm2，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié) 論 預構(gòu)的骨肌皮瓣帶血管蒂移位修復兔自體下頜骨和皮膚復合缺損具有可行性和明顯優(yōu)勢，有望成為一種血管化骨移植的供區(qū)預構(gòu)形式。
【摘 要】 目的 評價HA 復合rhBMP-2 的腺病毒（adenovirus mediated rhBMP-2，Adv-rhBMP-2）轉(zhuǎn)染的羊BMSCs 對骨痂延長骨愈合的影響。 方法 成年山羊19 只，雌雄不限，體重15 ～ 20 kg。于每只羊髂嵴上穿刺抽取骨髓10 mL，常規(guī)傳代培養(yǎng)BMSCs。取第3 代BMSCs，以感染復數(shù)200 轉(zhuǎn)染腺病毒。取0.25% 胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染后3 d 的細胞1 ×108 個，與HA 充分混勻制備Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA。建立山羊右側(cè)脛骨延長模型，術(shù)后立即于截骨部位注射自體細胞復合物。按術(shù)后注入物質(zhì)不同隨機分成4 組：A 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs/HA 組（n=6），B 組為Adv-rhBMP-2/BMSCs 組（n=5），C 組為Adv-β-gal/BMSCs/HA 組（n=4），D 組為空白組（n=4）。術(shù)后第7 天開始行脛骨延長，速度1 mm/d，共延長4 周。術(shù)后5、8、12 周攝X 線片觀察骨痂生長情況，12 周處死動物，取標本分別行骨密度檢測、生物力學測定、組織學觀察和骨形態(tài)計量學分析。 結(jié)果 X 線片檢查示，術(shù)后5、8 周A、B 組骨痂生成量明顯多于C、D 組，X 線片定量評分A、B 組明顯高于C、D 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；12 周各組均在骨延長部位形成連續(xù)骨痂。骨密度測定：術(shù)后12 周A、B、C、D 組延長部位骨礦物質(zhì)含量分別為（4.175 ± 1.921）、（2.600 ± 0.638）、（2.425 ± 0.826）和（1.175 ± 0.574） g，骨礦物質(zhì)密度分別為（0.612 ± 0.196）、（0.630 ± 0.159）、（0.450 ± 0.166）和（0.266 ± 0.113）g/cm2，A、B 組顯著高于C、D組（P lt; 0.05）。生物力學測定：A、B、C、D 組最大載荷分別為（490.20 ± 155.08）、（350.59 ± 80.48）、（221.95 ± 68.79）和（150.65 ± 92.29）N，彈性模量為（178.24 ± 105.80）、（105.88 ± 27.09）、（81.18 ± 48.67）和（50.35 ± 47.64）MPa，各指標A組顯著高于C、D 組（P lt; 0.05）。組織學觀察見A 組骨延長處大量新生骨組織，骨小梁多為縱行網(wǎng)狀排列。骨形態(tài)計量分析示A、B、C、D 組新骨體積分別為72.35% ± 5.68%、67.58% ± 7.42%、49.63% ± 4.87% 和38.87% ± 2.35%，A 組新生骨生成量明顯比D 組多（P lt; 0.05）。 結(jié)論 HA 復合rhBMP-2 修飾的BMSCs 制備的組織工程骨可促進羊脛骨延長骨愈合。
【摘 要】 目的 研究以聚-DL- 乳酸（poly-D,L-lactic acid，PDLLA）為載體復合rhBMP-2 接骨板的制備，并觀察其生物相容性，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法 將rhBMP-2 以0.05 mg/ 板與PDLLA 真空負壓抽吸復合，制備復合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板。新西蘭大白兔32 只，雌雄不限，體重（3.0 ± 0.5） kg。制備雙側(cè)尺骨中段2.5 mm 骨及骨膜缺損模型。取右側(cè)為實驗組（n=32），采用復合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板固定尺骨骨折處；左側(cè)為對照組（n=32），采用普通PDLLA 接骨板固定。于術(shù)后2、4、8 和12 周行大體、X 線片和組織學觀察，比較復合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板與普通PDLLA 接骨板的生物相容性。 結(jié)果 復合rhBMP-2 的PDLLA 接骨板孔隙率為90%，孔徑150 μm，拉伸強度gt; 50 MPa，三點抗彎強度gt; 90 MPa，特性黏度1.6 dL/g（氯仿溶劑）。動物切口均于1 ～ 2 周Ⅰ期愈合，動物飲食及活動恢復正常，無肢體活動受限及跛行。兩種接骨板均固定牢固，骨折端無移位，材料逐步降解，實驗組接骨板降解較對照組快。X 線片：實驗組術(shù)后2、4、8 及12 周骨折修復的X 線阻射密度值分別為39.22 ± 2.48、48.79 ± 1.26、63.78 ± 1.78 及78.60 ± 1.25；對照組分別為33.83 ± 1.13、41.28 ± 1.25、55.23 ± 0.68 及66.54 ± 1.33，兩組各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。組織學觀察，實驗組接骨板與周圍組織的相容性、成骨速度、骨再生量、再生髓腔結(jié)構(gòu)等方面均優(yōu)于對照組；實驗組術(shù)后2、4、8 及12 周骨缺損區(qū)新骨形成面積百分比分別為0.106% ± 0.015%、0.292% ± 0.019%、0.457% ± 0.048%及0.601% ± 0.037%；對照組分別為0、0.193% ± 0.019%、0.339% ± 0.029% 及0.574% ± 0.047%；不同時間點兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 復合 rhBMP-2 的PDLLA 接骨板生物相容性良好，較之普通PDLLA 接骨板具有更良好骨誘導性和骨折修復能力。
【摘 要】 目的 通過引入內(nèi)部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site，IRES），構(gòu)建帶有hVEGF165 及hBMP-7 雙基因的重組腺相關(guān)病毒載體（adeno-associated virus，AAV），并對其進行鑒定。 方法 以AAV 腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)（helper-free system）為基礎(chǔ)，將真核表達質(zhì)粒pIRES 中的IRES 片段定向克隆至腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAVMCS中，形成含有IRES 序列及上、下游多克隆位點的重組骨架質(zhì)粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR 擴增hVEGF165 和hBMP-7 基因，先后亞克隆入重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒IRES 序列上、下游的多克隆位點，獲得重組質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。將其和包裝質(zhì)粒pAAV-RC、輔助質(zhì)粒pHelper 三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293 細胞，包裝重組腺相關(guān)病毒rAAVhVEGF165-IRES-hBMP-7，同時包裝含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的重組病毒rAAV-IRES-GFP作平行對照。熒光顯微鏡下監(jiān)測病毒包裝效率，收獲重組病毒后感染AAV-HT1080 細胞測定病毒滴度，并通過病毒基因組外源基因擴增鑒定重組病毒的包裝是否成功。 結(jié)果 重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 經(jīng)雙酶切鑒定正確。熒光顯微鏡下觀察三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293 細胞72 h 后，病毒包裝效率達95% ～ 100%，收獲的重組病毒具有較高濃度及活性，感染AAV-HT1080 效率達90%，熒光計數(shù)法測定病毒感染滴度達5.5 × 1011 vp/mL。提取重組病毒基因組成功擴增出外源目的基因hVEGF165 及hBMP-7 片段，重組病毒包裝成功。 結(jié)論 成功構(gòu)建帶有hVEGF165 及hBMP-7 雙基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7，收獲的病毒具有較高滴度，為今后利用腺相關(guān)病毒載體進行hVEGF165 及hBMP-7 雙基因共表達影響骨修復的體外及體內(nèi)研究提供實驗基礎(chǔ)。