目的 對乳豬竇房結(jié)所在部位進行準確定位，建立一套可靠的竇房結(jié)細胞取材、分離、純化培養(yǎng)技術(shù)；觀察竇房結(jié)細胞與Col Ⅰ纖維支架的相容性。 方 法 24 h 內(nèi)新生純種長白山乳豬5 只，雌雄不拘，體重0.45 ～ 0.55 kg。實驗動物采用多導電生理記錄儀標記房波最早出現(xiàn)的部位，在該位置取材行原代竇房結(jié)細胞培養(yǎng)，分別采用常規(guī)方法培養(yǎng)和差速貼壁分離技術(shù)、5-BrdU 處理純化培養(yǎng)；于左心房部位取材行心房肌細胞純化培養(yǎng)作為對照。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、細胞貼壁時間、單細胞出現(xiàn)搏動時間、搏動頻率等。將純化培養(yǎng)的竇房結(jié)細胞以5 × 105 個/mL 密度接種至經(jīng)預(yù)濕處理的Col Ⅰ纖維支架復合培養(yǎng)5 d，行HE 染色觀察及掃描電鏡觀察。 結(jié)果 房波最早出現(xiàn)的位置即為竇房結(jié)所在部位。純化培養(yǎng)的竇房結(jié)細胞有3 種形態(tài)，即梭形、三角形與不規(guī)則形，其中梭形細胞最多；心房肌細胞主要為三角形及不規(guī)則形，而無梭形細胞。竇房結(jié)細胞純化培養(yǎng)與常規(guī)培養(yǎng)比較，梭形細胞所占比例分別為73.0% ± 2.9%、44.7% ± 2.3%，二者差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；不規(guī)則形細胞分別為7.0% ± 1.7%、36.1% ± 2.6%，二者差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；三角形細胞分別為20.0% ± 2.1%、19.2% ± 2.5%，二者差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。竇房結(jié)細胞復合Col Ⅰ纖維支架培養(yǎng)5 d，HE 染色觀察示Col Ⅰ纖維支架材料中有大量細胞；掃描電鏡見細胞成團吸附于支架表面及孔隙側(cè)壁，并可見細胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上。 結(jié)論 通過準確竇房結(jié)定位，采用差速貼壁結(jié)合5-BrdU 處理的純化培養(yǎng)可明顯提高乳豬竇房結(jié)梭形細胞比例，是一種可靠的竇房結(jié)細胞純化培養(yǎng)技術(shù)。竇房結(jié)細胞和Col Ⅰ纖維支架有較好的細胞相容性。
目的 研究成肌細胞移植治療假肥大型肌營養(yǎng)不良癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）的效果，探討基因治療DMD 的方法及可行性。 方法 用多步酶消化法與差速貼壁法培養(yǎng)C57/BL10 小鼠成肌細胞，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。取第4 代細胞用5-BrdU 標記。將24 只DMD 模型鼠——mdx 小鼠（4 ～ 6 周齡，雄性，體重13.8 ～ 24.6 g）隨機分為兩組（n=12），A 組經(jīng)尾靜脈分2 次（間隔2 周）注射1 × 106 個/mL 標記后成肌細胞，B 組同法注射1 mL DMEM/F12 培養(yǎng)基為對照。術(shù)后4 周采用一次性游泳力竭實驗檢測小鼠運動能力，處死后取材行HE 染色及5-BrdU、結(jié)蛋白、抗肌萎縮蛋白（dystrophin，Dys）免疫組織化學染色觀察，并行圖像分析。 結(jié)果 原代成肌細胞培養(yǎng)5 ～ 7 d 后即可傳代，可獲得穩(wěn)定傳代及足量的細胞。A 組小鼠一次性游泳力竭時間為（60.72 ± 5.76）min，B 組為（47.77 ± 5.40） min，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。術(shù)后4 周HE 染色示A 組可見變成圓形且透明染色的肌細胞，肌纖維細胞核中心移位（centrally nucleated fibers，CNF）比例為67%；B 組肌纖維粗細不等，可見肥大、萎縮、變性和肌纖維壞死等改變，CNF 比例gt; 80%。免疫組織化學染色示，A 組5-BrdU、結(jié)蛋白、Dys 表達均呈陽性，B 組少見表達或呈陰性表達。圖像分析結(jié)果顯示，A、B 組結(jié)蛋白積分吸光度（IA）值分別為489.70 ± 451.83 和71.15 ± 61.14，陽性面積占視野總面積的比值分 別為0.314 3 ± 0.197 3 和0.102 8 ± 0.062 8（P lt; 0.05） ；Dys IA 值分別為5 424.64 ± 2 658.01 和902.12 ± 593.51（P gt; 0.05）， 陽 性面積占視野總面積的比值分別為0.323 7 ± 0.117 7 和0.035 2 ± 0.032 9（P lt; 0.05）。 結(jié)論 成肌細胞移植治療小鼠DMD 有一定的治療作用。
目的探討大鼠軟骨非全層損傷模型的制備及術(shù)后細胞變化及細胞活化與整合素β1表達的關(guān)系。 方法10周齡SD雄性大鼠45只，體質(zhì)量300～400 g，隨機分為手術(shù)組、假手術(shù)組和對照組，每組15只。手術(shù)組采用劃痕法制造軟骨非全層損傷模型；假手術(shù)組打開膝關(guān)節(jié)囊后直接縫合；對照組不行手術(shù)。術(shù)后1、7、14 d各組分別處死5只大鼠，取材行大體觀察；并行HE、番紅O組織學染色，評估并比較各組HE染色改良組織學評分及番紅O染色灰度值；行BrdU、CD105免疫熒光染色和CD105/整合素β1雙標記染色，采用標準雙盲法計數(shù)并比較各組各時間點CD105陽性細胞數(shù)。 結(jié)果大體觀察示手術(shù)組劃痕周圍軟骨欠光滑，非透明，有軟骨軟化、纖維化改變，且隨造模時間延長逐漸加重；假手術(shù)組和對照組軟骨呈白色透明狀，無軟化、纖維化改變。HE染色示手術(shù)組在劃痕周圍細胞數(shù)增多，大小不等，排列分布不均；假手術(shù)組和對照組細胞大小均一，染色均勻，排列有序。手術(shù)組術(shù)后各時間點HE染色改良組織學評分均顯著高于假手術(shù)組及對照組（P＜0.05），各組組內(nèi)各時間點間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。番紅O染色示手術(shù)組各時間點染色欠均勻，劃痕周圍區(qū)域著色較淺；假手術(shù)組和對照組各時間點染色均勻，無失染。術(shù)后各時間點各組間比較以及各組內(nèi)各時間點間比較番紅O染色灰度值，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。BrdU免疫熒光染色示手術(shù)組劃痕周圍細胞排列紊亂，分布不均；假手術(shù)組和對照組細胞排列分布均勻，無聚集現(xiàn)象。CD105免疫熒光染色示手術(shù)組劃痕周圍有較多陽性細胞聚集，細胞大小不一、分布不均；假手術(shù)組和對照組軟骨層見少數(shù)陽性細胞，分布均勻。手術(shù)組術(shù)后各時間點CD105陽性細胞數(shù)均顯著多于假手術(shù)組和對照組（P＜0.05）；手術(shù)組內(nèi)隨時間延長CD105陽性細胞數(shù)逐漸增多，各時間點間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD105/整合素β1雙熒光標記染色示手術(shù)組劃痕周圍有雙標陽性細胞聚集，假手術(shù)組和對照組各時間點均未觀察到雙標陽性細胞。 結(jié)論通過劃痕能夠建立大鼠軟骨非全層損傷模型，且損傷無法完全修復。劃痕造成的軟骨損傷周圍存在活化細胞聚集現(xiàn)象，細胞的活化與軟骨基質(zhì)改變關(guān)系不大；這些活化細胞處于增殖活躍狀態(tài)，可同時表達CD105和整合素β1。
目的 觀察PKH26 與BrdU 體外雙重標記兔BMSCs 的生物學特性，并體外構(gòu)建組織工程心肌補片。 方法 取6 月齡新西蘭大白兔分離培養(yǎng)BMSCs，并用細胞膜熒光染料PKH26 和細胞核標記物BrdU 對BMSCs 進行標記，通過倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細胞儀、MTT 法觀察細胞生長狀態(tài)和熒光標記前后細胞生物學特性的變化；ALP、茜素紅、油紅O 染色及骨鈣素、Ⅰ型膠原蛋白等免疫細胞化學技術(shù)檢測，觀察和評價標記前后BMSCs 體外分化為成骨細胞和成脂細胞的能力。將標記細胞與小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）復合后共培養(yǎng)5 ～ 7 d 構(gòu)建組織工程心肌補片，在倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡和掃描電鏡下觀察細胞在SIS 上的生長情況，并做活體及石蠟包埋HE 染色觀察。 結(jié)果 標記后細胞生長狀態(tài)良好，基本生長特性無明顯改變；熒光顯微鏡下可見標記后細胞膜上紅色熒光呈顆粒狀分布；細胞表面干細胞標志性抗原表達與標記前無明顯差異。標記后的BMSCs 成骨誘導后，ALP、茜素紅染色陽性，細胞表達骨鈣素及Ⅰ型膠原蛋白；成脂誘導后，細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴。標記細胞與SIS 共培養(yǎng)5 ～ 7 d 后，標記細胞生長狀態(tài)良好，在材料上呈現(xiàn)出多層細胞結(jié)構(gòu)?；铙w及石蠟包埋后HE 染色可見細胞生長狀態(tài)良好。 結(jié)論 兔BMSCs 能被PKH26 和BrdU 穩(wěn)定標記；標記的細胞在體外具有自我更新和多向分化的能力；標記的BMSCs 與SIS 體外復合培養(yǎng)可以構(gòu)建組織工程心肌補片。