目的 探討NGF 對骨折愈合的影響，以及對BMP-2 誘導成骨的作用。 方法 清潔級雄性6 ～ 8 周昆明小鼠60 只，體重23 ～ 25 g，隨機分為4 組，每組15 只。建立股骨中段不穩(wěn)定軟骨內(nèi)成骨骨折模型，A、B、C、D 組分別于骨折斷端局部使用NGF/ 生理鹽水、BMP-2、BMP-2/NGF/ 生理鹽水、生理鹽水。各組分別于術(shù)后14、21 和28 d 各處死5 只小鼠，并于骨折部位取材行大體、X 線片觀察、生化檢測及組織學觀察。處死小鼠前取小鼠眼球球后動靜脈血液行血清ALP 活性測定。 結(jié)果 術(shù)后各時間點，大體觀察A、B、C 組局部新生硬組織大小、硬度，骨折斷端骨痂生長依次增加，均高于D 組。X 線片觀察A、B、C 組骨折線逐漸模糊，鈣化面積依次增大，均快于D 組。組織學觀察A、B、C 組骨小梁成熟度依次增加，均優(yōu)于D 組。術(shù)后各時間點，A、B、C 組成骨面積和成骨區(qū)灰度值、血清ALP 含量、骨痂組織中ALP含量和鈣含量、骨痂濕重均高于D 組。術(shù)后各時間點各組成骨面積和成骨區(qū)灰度值比較、術(shù)后14 d 各組血清中ALP 含量比較、術(shù)后14 d 和21 d 各組骨痂組織中ALP 含量比較、術(shù)后21 d 和28 d 各組骨痂組織中鈣含量及骨痂濕重比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。術(shù)后14 d，B、C 組與A、D 組比較骨痂濕重差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。術(shù)后21、28 d，骨組織形態(tài)計量分析顯示各組新生骨骨小梁表面成骨細胞指數(shù)、平均骨小梁面積百分比和平均骨小梁寬度隨時間增大依次減小，A、B、C 組依次增大，均高于D 組，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 NGF 有促進骨折愈合作用，且具有協(xié)同BMP-2 誘導成骨的作用。
目的 構(gòu)建攜帶NGF 基因序列的5 型腺病毒（adenovirus expressing NGF，Ad-NGF），探討其在促進大鼠坐骨神經(jīng)神修復與再生中的作用。 方法 將NGF 基因序列克隆至5 型腺病毒穿梭質(zhì)粒pCA13，并在HEK-293 細胞中包裝得到重組腺病毒Ad-NGF 并測序鑒定。雄性SD 大鼠32 只，體重180 ～ 200 g，隨機分為4 組（n=8）。切斷大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)并縫合，建立坐骨神經(jīng)損傷模型。模型制備后，A 組及C 組分別于術(shù)側(cè)腓腸肌注射Ad-NGF 及不攜帶NGF基因序列的空腺病毒載體，1 × 108 PFU/ 次，隔天1 次，共3 次； B 組及D 組分別于術(shù)側(cè)腓腸肌注射NGF（200 U/d）及生理鹽水（100 μL/d），連續(xù)3 周。術(shù)后第31 天檢測坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、神經(jīng)電生理檢測，取吻合處及其遠端1 cm 坐骨神經(jīng)，采用RT-PCR 及Western blot 技術(shù)定量檢測大鼠損傷坐骨神經(jīng)中NGF mRNA 及蛋白的表達水平，并行組織學及免疫組織化學、透射電鏡觀察。 結(jié)果 實驗成功構(gòu)建了攜帶NGF 基因序列的5 型腺病毒Ad-NGF。A 組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)、神經(jīng)傳導速度、誘發(fā)電位波幅及潛伏期與B、C、D 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；B、C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。RT-PCR 及Western blot 檢測顯示，A 組NGF mRNA 及蛋白表達量與B、C、D 組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；B、C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。組織學及免疫組織化學觀察示A 組坐骨神經(jīng)再生情況明顯優(yōu)于其他組。透射電鏡觀察示A 組坐骨神經(jīng)橫切面軸突直徑、髓鞘厚度、神經(jīng)纖維個數(shù)與B、C、D 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；B、C、D 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 Ad-NGF 提供了一種在周圍神經(jīng)損傷局部獲得大量NGF 的新方法，且可有效促進大鼠坐骨神經(jīng)損傷后的修復。
目的 研究NGF 對人真皮成纖維細胞增殖、細胞周期、膠原合成和遷移的影響，探討NGF 在創(chuàng)傷修復中的作用。 方法 采用酶消化法體外分離培養(yǎng)人真皮成纖維細胞，取第3 代細胞進行實驗。分別加入0、25、50、100、200、400 ng/mL NGF，培養(yǎng)48 h 采用MTT 法檢測細胞增殖；加入0、100 ng/mL NGF，培養(yǎng)48 h 采用流式細胞儀分析細胞有絲分裂周期，采用羥脯氨酸法檢測培養(yǎng)液膠原含量，實時熒光定量PCR 測定細胞Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA 表達水平；建立體外細胞劃痕創(chuàng)傷模型，加入0、50、100、200 ng/mL NGF，培養(yǎng)24 h 觀察細胞遷移。 結(jié)果 MTT 法檢測結(jié)果顯示，各濃度組間細胞增殖的吸光度值比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。在0、100 ng/mL NGF 作用下，細胞周期顯示兩組的G0/ G1 期、S 期、G2/M 期細胞百分率差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05），羥脯氨酸法測得兩組細胞培養(yǎng)液膠原含量和實時熒光定量PCR 測定細胞Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA 表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。細胞遷移實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h 后0、50、100、200 ng/mL NGF 濃度組細胞遷移率分別為52.12% ± 6.50%、80.67% ± 8.51%、66.33% ± 3.58% 和61.19% ± 0.97%，50、100 ng/mL NGF 可顯著促進細胞遷移（P lt; 0.05）。 結(jié)論 NGF 對人真皮成纖維細胞增殖、細胞周期及Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA 表達無影響，不能促進膠原合成，但能促進人真皮成纖維細胞遷移。
目的 制備NGF-胰島素復合凝膠并觀察其對大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的影響。 方法以卡波姆980為基質(zhì)，分別加入NGF 4 000 U、胰島素800 U，制備胰島素凝膠、NGF凝膠、NGF-胰島素復合凝膠。觀察NGF-胰島素復合凝膠性狀，并行體外藥物釋放檢測。75只SPF級雄性Wistar大鼠，體重200～250 g，隨機分為正常對照組（A組）、糖尿病對照組（B組）、局部胰島素凝膠治療組（C組）、局部NGF凝膠治療組（D組）、局部NGF-胰島素復合凝膠治療組（E組），每組15只。B、C、D、E組大鼠采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（55 mg/kg）制備1型糖尿病模型，A組注射相同劑量檸檬酸鈉緩沖液。造模成功后，采用恒溫水浴箱法于各組大鼠背部制備深Ⅱ度燙傷模型。A、B組創(chuàng)面外敷空白凝膠基質(zhì)，C、D、E組對應外敷胰島素凝膠、NGF凝膠、NGF-胰島素復合凝膠，每天換藥1次。燙傷后觀察各組大鼠存活情況，于3、7、11、15、21 d觀察創(chuàng)面愈合情況并計算創(chuàng)面愈合率，各時間點每組處死3只大鼠取皮膚全層標本行組織學及免疫組織化學染色觀察。 結(jié)果制備的NGF-胰島素復合凝膠清亮透明，保濕性及黏附性良好，易于涂抹及清洗。體外釋放檢測示NGF-胰島素復合凝膠釋藥時間可達24 h以上，且30 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。各組大鼠均存活至實驗完成。燙傷后3 d各組創(chuàng)面無縮小，7、11、15、21 d時E組創(chuàng)面愈合率最高，B組最低，與其余各組比較以及E、B組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。組織學觀察示各時間點E組肉芽組織和膠原纖維生長均優(yōu)于其余各組。免疫組織化學染色示各組CD34、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）均于3 d開始表達，且隨時間延長陽性細胞逐漸增多；各時間點E組微血管密度及PCNA最高，B組最低，與其余各組比較以及E、B組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論局部應用NGF-胰島素復合凝膠可顯著促進大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合。
目的 改進雪旺細胞（Schwann cells，SCs）原代培養(yǎng)方法，以獲得大量高純度SCs；研究豬小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）與SCs的生物相容性；通過復合SCs，使SIS負載NGF。 方法取2～3日齡SD乳鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，以胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶分步消化，差速貼壁20 min，G418處理48 h，含2.5%FBS的H-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；MTT法檢測SCs增殖情況，抗S-100免疫熒光染色檢測SCs純度。將第3代SCs和SIS復合培養(yǎng)，行HE染色和掃描電鏡觀察兩者復合生長情況，復合培養(yǎng)1、2、3、4、5、7 d ELISA法檢測培養(yǎng)上清中NGF含量。復合培養(yǎng)3、5、7、10、13、15 d后反復凍融脫細胞處理，ELISA法檢測脫細胞后SIS中NGF含量。 結(jié)果純化后的SCs純度達98%以上；MTT檢測示SCs傳代后3 d進入對數(shù)生長期，7 d后進入平臺期。HE染色和掃描電鏡觀察均顯示SCs在SIS上黏附良好，細胞形態(tài)呈紡錘形，有明顯突起，分泌較多細胞外基質(zhì)。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)SCs與SIS復合培養(yǎng)后，培養(yǎng)上清中的NGF含量隨時間延長而逐漸升高，與同時間點對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。通過與SCs復合后反復凍融脫細胞，SIS中NGF含量在培養(yǎng)10 d達峰值（414.29 ± 20.87）pg/cm2，顯著高于未復合細胞的單純SIS材料中NGF含量（4.92 ± 2.06） pg/ cm2，比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論聯(lián)合雙酶消化、差速貼壁、G418處理、低濃度酶消化和低濃度血清培養(yǎng)，可在較短時間內(nèi)獲得大量高純度SCs。SCs與SIS復合生長相容性好，不影響SCs的NGF分泌。通過與SCs的復合、反復凍融脫細胞后，SIS中負載了大量NGF，有望成為良好的神經(jīng)修復材料。
目的 探討局部應用NGF 聯(lián)合胰島素對糖尿病大鼠燙傷創(chuàng)面血管中凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax 表達的影響及創(chuàng)面愈合的機制。 方法 取75 只清潔級雄性Wistar 大鼠，體重200 ～ 220 g，隨機分為正常對照組（A 組）、糖尿病對照組（B 組）、胰島素治療組（C 組）、NGF 治療組（D 組）、NGF 聯(lián)合胰島素治療組（E 組），每組15 只。B、C、D、E 組大鼠采用兩步給藥法腹腔注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）建立糖尿病模型，STZ 劑量分別為第1 天10 mg/kg，第3 天50 mg/kg；A 組給予相同劑量檸檬酸緩沖液。模型制備后1 個月，采用水蒸氣燙傷法于各組大鼠背部制備2 個深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面。燙傷模型制備后，A、B 組創(chuàng)面外敷3 層生理鹽水紗布；C 組創(chuàng)面外敷3 層浸潤5 U 胰島素諾和靈30R 的紗布，并每日腹部皮下注射諾和靈30R 4 ～ 6 U/kg；D 組創(chuàng)面外敷3 層浸潤5 mL NGF 溶液（25 U/mL）的紗布；E 組聯(lián)合C、D組方法處理。觀察大鼠一般情況，傷后7、11、15、21 d 大體觀察各組創(chuàng)面愈合情況并計算創(chuàng)面愈合率，傷后3、7、11、15、21 d 取創(chuàng)面組織行組織學及免疫組織化學染色觀察，檢測創(chuàng)面Bcl-2、Bax、CD34 的表達并計算微血管密度。 結(jié)果 各組大鼠均存活至實驗完成。隨時間延長，各組創(chuàng)面逐漸縮小，其中E 組創(chuàng)面愈合速度、皮膚角化、毛發(fā)生長及肉芽組織和膠原纖維生長均優(yōu)于其余各組。傷后各時間點E 組創(chuàng)面愈合率均高于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。傷后隨時間延長，各組CD34、Bcl-2 表達逐漸增強，至15 d 達高峰，21 d 表達減弱；E 組各時間點表達均強于其他各組（P lt; 0.05）。傷后3 d 各組均未見Bax 表達，7 d 后開始見新生血管內(nèi)皮細胞Bax 表達，且隨時間延長表達逐漸增強，其中E 組表達強度均低于其余各組（P lt; 0.05）。 結(jié)論 局部聯(lián)合應用NGF 和胰島素可通過抑制創(chuàng)面血管內(nèi)皮細胞凋亡、增加創(chuàng)面血管生成，促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合。
目的 通過研究局部應用不同濃度NGF 對骨折愈合的影響，進一步探討NGF 促進骨折愈合的適宜濃度。 方法 成年雄性SD 大鼠75 只，體重（220.0 ± 2.5）g，隨機分成A、B、C、D、E 5 組（n=15）。實驗動物建立右脛骨中上段骨折模型，A、B、C、D 組分別于骨折斷端局部注射含0.006 48 × 10-2、0.032 40 × 10-2、0.162 00 × 10-2、0.810 00 ×10-2 μg/g NGF 的生理鹽水0.3 mL，每天1 次，連續(xù)注射7 d；E 組注射等量生理鹽水。各組分別于術(shù)后2、4、6 周各處死5只大鼠，并于骨折部位取材行大體、X 線片觀察、生化檢測及組織學觀察。處死大鼠前取大鼠眼球球后動、靜脈血液行血清ALP 活性測定。 結(jié)果 術(shù)后各時間點，大體觀察表明A、B、C、D 組局部新生硬組織大小、硬度、骨折斷端骨痂生長逐漸遞增，D 組明顯優(yōu)于A、B、C、E 組。X 線片示A、B、C、D 組骨折線逐漸模糊，鈣化面積逐漸增大，D 組骨痂鈣化明顯快于A、B、C 組和E 組。組織學觀察示D 組骨小梁質(zhì)量及成熟度明顯優(yōu)于A、B、C 組和E 組。D 組術(shù)后4、6 周成骨區(qū)灰度值、骨痂鈣含量，2、4 周骨痂組織濕重及2 周血清ALP 含量均顯著高于A、B、C 組和E 組，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。術(shù)后2、4 周，骨組織形態(tài)計量分析顯示各組新生骨骨小梁表面成骨細胞指數(shù)、骨小梁面積百分比和骨小梁寬度隨時間延長而減?。煌粫r間點A、B、C、D 組依次增大，均大于E 組，且差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 局部應用NGF 對大鼠骨折愈合有促進作用，高濃度的NGF（0.810 00 × 10-2 μg/g）對骨折愈合有顯著促進作用。
為了解神經(jīng)生長因子（ＮＧＦ）對損傷的脊髓組織的作用，采用Ａｌｅｎ氏ＷＤ裝置，以１０ｇ沖擊棒自２．５ｃｍ高度下落撞擊ＳＤ大鼠Ｔ８脊髓，并于蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)置入導管。術(shù)后，實驗組經(jīng)導管注入ＮＧＦ溶液；對照組則注入生理鹽水。術(shù)后４，８及２４ｈ，取脊髓損傷段標本，分別經(jīng)干濕法、原子吸收光譜法測量水、鈣含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：損傷脊髓段組織鈣含量明顯增高，組織水腫嚴重；脊髓損傷后，應用ＮＧＦ可顯著改善這些變化。這一實驗結(jié)果證實ＮＧＦ對受傷的脊髓有明顯的保護作用，其保護作用與穩(wěn)定鈣離子水平有關(guān)。
目的探討以濃度梯度方式負載NGF的周圍神經(jīng)導管修復大鼠周圍神經(jīng)缺損的效果。 方法采用聚己內(nèi)酯-丙交酯嵌段共聚物制備周圍神經(jīng)導管。取10 μg NGF溶解于1 mL 3%絲蛋白溶液中，采用直接浸泡或用微量注射泵按3.2 μL/min注入方式，分別制備均勻負載及濃度梯度負載NGF的周圍神經(jīng)導管。采用ELISA試劑盒檢測兩種導管12周NGF累積釋放量。取雄性成年SD大鼠24只，體重220～250 g，制備右側(cè)坐骨神經(jīng)14 mm缺損模型。根據(jù)修復方法不同，隨機分為4組（n=6）：A、B、C、D組分別采用單純周圍神經(jīng)導管、均勻負載NGF的周圍神經(jīng)導管、濃度梯度負載NGF的周圍神經(jīng)導管、自體神經(jīng)修復缺損。術(shù)后觀察大鼠一般情況，12周取材行大體觀察、電生理檢測、組織學觀察及透射電鏡觀察，分析神經(jīng)再生情況。 結(jié)果濃度梯度負載及均勻負載NGF的周圍神經(jīng)導管12周內(nèi)NGF累積釋放量分別為（14.2±1.4）、（13.7±1.3）ng/mg，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.564，P=0.570）。大鼠均存活至實驗完成，術(shù)后4 d出現(xiàn)足底部潰瘍，12周時基本愈合；其中C、D組大鼠愈合情況優(yōu)于A、B組。術(shù)后12周，A組復合肌肉動作電位顯著低于B、C、D組，B組顯著低于C、D組（P＜0.05）；C、D組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。組織學及透射電鏡觀察示，C組軸突密度顯著高于A、B、D組（P＜0.05）；D組軸突總數(shù)、軸突直徑及肌纖維橫截面積顯著高于A、B、C組，C組高于A、B組（P＜0.05）；C、D組髓鞘厚度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但均優(yōu)于A、B組（P＜0.05）。 結(jié)論負載濃度梯度NGF的周圍神經(jīng)導管修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損效果與自體神經(jīng)修復接近，可促進坐骨神經(jīng)再生、再生神經(jīng)纖維排列規(guī)律化、提高再生神經(jīng)髓鞘化、加速再生神經(jīng)功能重建。
目的構(gòu)建攜帶NGF及髓磷脂相關(guān)糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）基因序列的雙基因共表達腺病毒（adenovirus expressing NGF and MAG，Ad-NGF-MAG），探討其在大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復中的作用。 方法將NGF和MAG共同克隆至5型腺病毒穿梭質(zhì)粒pCA13，并在HEK293細胞中包裝得到重組腺病毒Ad-NGF-MAG并測序鑒定。取雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量180～200 g；隨機分成4組（n=8）：對照組（正常對照）、空病毒組（Ad組）、單獨表達NGF組（Ad-NGF組）和共表達NGF、MAG組（Ad-NGF-MAG組）。Ad組、AdNGF組和Ad-NGF-MAG組大鼠制備右側(cè)坐骨神經(jīng)損傷模型后，分別于術(shù)側(cè)腓腸肌注射空腺病毒、Ad-NGF及AdNGF-MAG（1×108 PFU），隔天1次，共3次。對照組僅暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)后關(guān)閉切口，術(shù)后對應時間點注射生理鹽水10 μL。術(shù)后31 d，分別行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（sciatic nerve function index，SFI）、神經(jīng)電生理檢測；切取坐骨神經(jīng)標本，行RT-PCR及Western blot檢測NGF及MAG mRNA及蛋白表達水平，以及組織學觀察。 結(jié)果實驗成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-NGF和Ad-NGF-MAG。32只大鼠術(shù)后均成活，切口Ⅰ期愈合。Ad-NGF-MAG組SFI、神經(jīng)傳導速度、誘發(fā)電位波幅、潛伏期均明顯優(yōu)于Ad-NGF組和Ad組，但未達對照組水平，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ad-NGF-MAG組內(nèi)MAG mRNA和蛋白表達最高，NGF mRNA和蛋白表達高于對照組和Ad組，比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組織學觀察顯示，對照組神經(jīng)連續(xù)性好，Ad組神經(jīng)纖維層次混亂，Ad-NGF組神經(jīng)纖維層次結(jié)構(gòu)清晰，局部斷端再生良好，但神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)紊亂；Ad-NGF-MAG組神經(jīng)纖維生長有序，神經(jīng)直徑較Ad-NGF組粗，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)良好。 結(jié)論坐骨神經(jīng)損傷后修復過程中，腺病毒介導NGF與MAG共表達，既可促進神經(jīng)纖維生長，又可抑制神經(jīng)異常分支形成，促進神經(jīng)結(jié)構(gòu)與功能的恢復。