目的體外評(píng)估PKH26標(biāo)記對(duì)山羊髓核細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，并結(jié)合活體熒光成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)種子細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生物學(xué)行為。 方法取1歲齡山羊椎間盤(pán)分離髓核組織，通過(guò)酶消化法獲取原代細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察，傳代獲取第1代髓核細(xì)胞，行PKH26熒光標(biāo)記，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記后的細(xì)胞熒光強(qiáng)度，并行甲苯胺藍(lán)和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察，錐蟲(chóng)藍(lán)染色比較標(biāo)記前后細(xì)胞活性，MTT法檢測(cè)標(biāo)記前后細(xì)胞增殖特性，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達(dá)。將標(biāo)記后的髓核細(xì)胞接種至一體化纖維化-髓核支架的髓核部分，纖維環(huán)部分作為陰性對(duì)照，體外培養(yǎng)3 d后植入5只6周齡雄性裸鼠體內(nèi)，培養(yǎng)6周后活體成像技術(shù)檢測(cè)髓核細(xì)胞-支架復(fù)合物在體內(nèi)的熒光強(qiáng)度及范圍。結(jié)果 倒置相差顯微鏡觀察示原代髓核細(xì)胞簇狀生長(zhǎng)，呈卵圓形，第1代髓核細(xì)胞呈類(lèi)軟骨樣細(xì)胞形態(tài)；標(biāo)記后的第1代髓核細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色均呈陽(yáng)性；標(biāo)記后熒光強(qiáng)度均勻，標(biāo)記前后細(xì)胞活性均在95%以上；標(biāo)記前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)示標(biāo)記前后細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原和蛋白聚糖基因相對(duì)表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）?；铙w成像技術(shù)顯示體內(nèi)髓核支架有強(qiáng)烈熒光，纖維環(huán)支架未見(jiàn)熒光。結(jié)論 PKH26標(biāo)記對(duì)髓核細(xì)胞的活性、增殖及細(xì)胞表型的表達(dá)無(wú)明顯影響，結(jié)合體內(nèi)活體熒光成像系統(tǒng)可以追蹤細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為。
目的 觀察PKH26 與BrdU 體外雙重標(biāo)記兔BMSCs 的生物學(xué)特性，并體外構(gòu)建組織工程心肌補(bǔ)片。 方法 取6 月齡新西蘭大白兔分離培養(yǎng)BMSCs，并用細(xì)胞膜熒光染料PKH26 和細(xì)胞核標(biāo)記物BrdU 對(duì)BMSCs 進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、MTT 法觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和熒光標(biāo)記前后細(xì)胞生物學(xué)特性的變化；ALP、茜素紅、油紅O 染色及骨鈣素、Ⅰ型膠原蛋白等免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)，觀察和評(píng)價(jià)標(biāo)記前后BMSCs 體外分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞的能力。將標(biāo)記細(xì)胞與小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）復(fù)合后共培養(yǎng)5 ～ 7 d 構(gòu)建組織工程心肌補(bǔ)片，在倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡和掃描電鏡下觀察細(xì)胞在SIS 上的生長(zhǎng)情況，并做活體及石蠟包埋HE 染色觀察。 結(jié)果 標(biāo)記后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，基本生長(zhǎng)特性無(wú)明顯改變；熒光顯微鏡下可見(jiàn)標(biāo)記后細(xì)胞膜上紅色熒光呈顆粒狀分布；細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志性抗原表達(dá)與標(biāo)記前無(wú)明顯差異。標(biāo)記后的BMSCs 成骨誘導(dǎo)后，ALP、茜素紅染色陽(yáng)性，細(xì)胞表達(dá)骨鈣素及Ⅰ型膠原蛋白；成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)明顯的脂滴。標(biāo)記細(xì)胞與SIS 共培養(yǎng)5 ～ 7 d 后，標(biāo)記細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，在材料上呈現(xiàn)出多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)?；铙w及石蠟包埋后HE 染色可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。 結(jié)論 兔BMSCs 能被PKH26 和BrdU 穩(wěn)定標(biāo)記；標(biāo)記的細(xì)胞在體外具有自我更新和多向分化的能力；標(biāo)記的BMSCs 與SIS 體外復(fù)合培養(yǎng)可以構(gòu)建組織工程心肌補(bǔ)片。
目的 探討熒光染料PKH26 在構(gòu)建組織工程骨中作為細(xì)胞示蹤劑的可行性。 方法 取1 周齡新西蘭大白兔骨髓分離培養(yǎng)BMSCs，以PKH26 標(biāo)記第3 代BMSCs，熒光顯微鏡觀察并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記率；以成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)標(biāo)記后BMSCs 向成骨細(xì)胞分化，倒置相差顯微鏡觀察誘導(dǎo)后7、14 d 細(xì)胞形態(tài)變化，并于14 d 采用鈣鈷法檢測(cè)ALP 活性，茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色觀察誘導(dǎo)結(jié)果。將PKH26 標(biāo)記的BMSCs 接種于生物衍生骨材料，48 h 后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞與材料的復(fù)合情況；將細(xì)胞- 材料復(fù)合物植入成年新西蘭大白兔雙后肢肌袋，14、28 d 后熒光顯微鏡觀察標(biāo)記細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。 結(jié)果 熒光顯微鏡觀察PKH26 標(biāo)記的BM SCs 呈球形，呈現(xiàn)均勻分布的紅色熒光；培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞貼壁伸展，輪廓清晰可見(jiàn)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞染色陽(yáng)性率達(dá)97.2%。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎噙呅位蛄⒎叫危珽CM 分泌增多，ALP 及茜素紅染色均呈陽(yáng)性反應(yīng)。PKH26 標(biāo)記細(xì)胞與生物衍生骨材料復(fù)合培養(yǎng)48 h 后，熒光顯微鏡觀察可見(jiàn)材料表面及內(nèi)部發(fā)出紅色熒光。標(biāo)記細(xì)胞- 支架材料復(fù)合物植入肌袋后14 d，在植入?yún)^(qū)可見(jiàn)發(fā)出紅色明亮熒光的標(biāo)記細(xì)胞； 術(shù)后28 d，在植入?yún)^(qū)仍可見(jiàn)發(fā)出紅色熒光的細(xì)胞，但數(shù)量較14 d 時(shí)少，熒光強(qiáng)度也較弱。 結(jié)論 PKH26 標(biāo)記BMSCs 可作為一種體外構(gòu)建組織工程骨及短期體內(nèi)示蹤的有效手段。