目的 探討抑癌基因Ras相關區(qū)域家族1A （RASSF1A）基因在結(jié)腸癌組織以及相應正常結(jié)腸組織中的表達并分析其表達與結(jié)腸癌臨床病理因素之間的關系。方法 采用免疫組織化學SP法和Western blot法檢測34例結(jié)腸癌手術標本和相應的正常結(jié)腸組織中RASSF1A蛋白的表達水平，應用RT-PCR法檢測RASSF1AmRNA在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達情況。結(jié)果 ①免疫組織化學法結(jié)果：結(jié)腸癌組織中RASSF1A蛋白表達陽性率明顯低于其在正常結(jié)腸組織中的表達陽性率 〔35.3% （12/34）比97.1% （33/34），P＜0.05〕。結(jié)腸癌組織中RASSF1A蛋白的表達與腫瘤分化程度和TNM分期均有關（P＜0.05），即高、中分化及TNM分期較低（Ⅰ＋Ⅱ期）者的RASSF1A蛋白表達陽性率較高（P＜0.05）。②Western blot法結(jié)果：在34例結(jié)腸癌患者中RASSF1A蛋白表達水平明顯低于其在相應的正常結(jié)腸組織中的表達水平 〔0.316 8±0.019 6比0.914 4±0.177 6，P＜0.05〕；該結(jié)果與RT-PCR法檢測到的RASSF1A mRNA表達情況基本一致 〔0.158 9±0.223 7和0.572 3±0.193 9，P＜0.05〕。結(jié)論 RASSF1A基因的失表達可能在原發(fā)性結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，檢測RASSF1A的表達情況可為結(jié)腸癌的早期診斷提供幫助。
目的 研究miR-196b和HoxB8在結(jié)直腸癌組織中的表達及與其臨床病理特征的關系，并探討在結(jié)直腸癌組織中miR-196b與靶基因HoxB8表達的關系。方法 用實時熒光定量PCR技術檢測30例結(jié)直腸癌組織及對應的正常黏膜組織中miR-196bmRNA和HoxB8 mRNA的表達量，用Western blot法檢測HoxB8蛋白的表達。結(jié)果 miR-196bmRNA和HoxB8mRNA在結(jié)直腸癌組織中的表達量均高于其在對應的正常黏膜組織中的表達量（P＜0.05）。miR-196bmRNA的表達與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期（Ⅰ＋Ⅱ與Ⅲ＋Ⅳ）及遠處轉(zhuǎn)移均有關（P＜0.05），而與腫瘤部位、大小、大體類型、浸潤深度、組織分化程度、患者的年齡及性別均無關（P＞0.05）； HoxB8 mRNA的表達與結(jié)直腸癌的上述臨床病理特征均無關（P＞0.05）。miR-196bmRNA與HoxB8mRNA的表達存在負相關（r=-0.458，P＜0.05），而與HoxB8蛋白的表達無明顯相關性（r=-0.236，P＞0.05）。結(jié)論 miR-196b mRNA及HoxB8mRNA在結(jié)直腸癌組織中均呈高表達， miR-196b mRNA的高表達與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預后有關。miR-196b可能通過與靶基因HoxB8 mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合抑制HoxB8 mRNA的表達。
目的 研究上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關因子Snail、E-cadherin、N-cadherin與胃癌患者臨床病理特征、預后及胃癌腫瘤起始細胞表面標志物CD133表達的關系。方法 利用Western blot方法檢測50例胃癌及癌旁正常胃黏膜組織中EMT相關因子及CD133蛋白的定位及定量表達，分析EMT相關因子及CD133蛋白表達與胃癌患者的臨床病理學指標的關系，Spearman等級相關分析EMT相關因子和CD133表達的關系，Kaplan-Meier方法分析EMT相關因子及CD133表達與胃癌患者生存的關系。結(jié)果?、傥赴┙M織中Snail、N-cadherin及CD133蛋白表達相對灰度值明顯高于其在癌旁正常胃黏膜組織中的表達（Snail：0.599±0.114比0.259±0.108，P=0.020；N-cadherin：0.754±0.154比0.329±0.134，P=0.001；CD133：0.635±0.119比0.485±0.116，P=0.029），E-cadherin蛋白表達相對灰度值明顯低于其在癌旁正常胃黏膜組織中的表達（0.378±0.123比0.752±0.156，P=0.003）。②Snail蛋白、N-cadherin蛋白表達平均相對灰度值在有血管浸潤、淋巴管浸潤、N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤直徑≥5 cm和Ⅲ＋Ⅳ期胃癌患者中的表達明顯高于無血管浸潤、淋巴管浸潤、N0～N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤直徑＜5 cm和Ⅰ＋Ⅱ期的胃癌患者（P＜0.05），而E-cadherin蛋白表達平均相對灰度值在有血管浸潤、淋巴管浸潤、N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅲ＋Ⅳ期胃癌患者中的表達顯著低于無血管浸潤、淋巴管浸潤、N0～N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅰ＋Ⅱ期的胃癌患者（P＜0.05），CD133蛋白表達平均相對灰度值在有淋巴管浸潤、N3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑≥5 cm和Ⅲ＋Ⅳ期胃癌患者中的表達顯著高于無淋巴管浸潤、N0～N2淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑＜5cm和Ⅰ＋Ⅱ期的胃癌患者（P＜0.05）。③Snail、N-cadherin蛋白表達與CD133蛋白表達分別均呈正相關（rs=0.278，P=0.048；rs=0.406，P=0.003），而E-cadherin蛋白表達與CD133蛋白表達呈負相關（rs=-0.504，P=0.000）。④Snail、N-cadherin及CD133蛋白低表達組的生存時間明顯長于其高表達者 （P＜0.05），聯(lián)合EMT相關因子和CD133蛋白表達能夠最有效預測患者生存。結(jié)論 EMT與胃癌腫瘤起始細胞特性之間存在明顯相關，并且兩者與胃癌的高侵襲的臨床病理特征相關，聯(lián)合EMT相關因子Snail、E-cadherin、N-cadherin與CD133能夠最有效預測胃癌患者的預后。
目的檢測轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1在恒河猴肝移植術后急性排斥反應時肝組織中的表達水平，以評價其作為肝移植術后急性排斥反應早期診斷指標的價值。 方法采用改良血管袖套＋膽道支撐管＋動脈吻合法建立穩(wěn)定的恒河猴肝移植模型，將其隨機分為實驗組（圍手術期不給予免疫抑制治療）和對照組（圍手術期給予免疫抑制治療）。繼而分別在肝移植術后6 h、12 h、24 h和72 h四個時間點分別收集血清及肝組織，通過肝功能指標檢測及移植肝組織蘇木精-伊紅染色Banff評分評價其移植排斥反應情況，并應用免疫組織化學、Western blot法分別檢測TGF-β1蛋白表達情況。 結(jié)果①2組恒河猴肝移植術后12 h、24 h和72 h均有急性排斥反應發(fā)生，尤其肝移植后72 h時實驗組肝組織急性排斥反應重于對照組，Banff分級水平高于對照組（P＜0.05）。②2組術后ALT、AST和TBIL水平均隨著時間的延長呈上升趨勢（P＜0.05），在移植術后6 h和12 h時2組ALT、AST和TBIL水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在移植術后24 h和72 h時實驗組ALT、AST和TBIL水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。③免疫組織化學檢測TGF-β1蛋白表達結(jié)果：實驗組肝移植術后12 h后肝組織中TGF-β1免疫組織化學染色陽性面積百分率隨著時間延長不斷升高，且均明顯高于對照組相應時相（P＜0.05）。④Western blot檢測TGF-β1蛋白表達的半定量結(jié)果：實驗組和對照組均在6 h即開始隨著時間的延長呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，而實驗組上調(diào)的幅度較對照組大，在6 h、12 h、24 h和72 h時實驗組均分別明顯高于對照組相應時相，差異有統(tǒng)計學意義（P值分別是0.003、0.001、0.001、0.001）。 結(jié)論肝移植術后肝組織中TGF-β1水平升高提示機體細胞免疫功能增強，對肝移植術后急性排斥反應的早期診斷可能有一定意義。
目的構(gòu)建pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體，為研究TFPI-2基因的功能做準備。 方法從胎盤組織中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以PCR法進行擴增。將擴增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表達載體上，經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時測定其DNA序列。將pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體以脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000介導的方法轉(zhuǎn)染Top10感受態(tài)細胞（轉(zhuǎn)染組），同時設空白對照組（僅轉(zhuǎn)染pEGFP-N3質(zhì)粒）和未轉(zhuǎn)染組（不予轉(zhuǎn)染）。采用Western blot法檢測3組細胞中TFPI-2蛋白的表達情況。 結(jié)果總RNA經(jīng)分光光度法驗證，其純度符合PCR法擴增的要求。構(gòu)建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體經(jīng)XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，分別在708 bp處和4 700 bp處有特異擴增條帶，大小與理論值一致。DNA序列測定結(jié)果證實，pEFFP-N3-TFPI-2真核表達載體的序列完全正確。Western blot法結(jié)果顯示，TFPI-2蛋白的表達量轉(zhuǎn)染組為0.657 3±0.032 5，空白對照組為0.301 7±0.028 7，未轉(zhuǎn)染組為0.314 3±0.026 6，轉(zhuǎn)染組TFPI-2蛋白的表達量高于空白對照組和未轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 結(jié)論本實驗成功構(gòu)建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體，為TFPI-2基因功能的研究奠定了基礎。
目的 研究蛋白基因產(chǎn)物9.5（protein gene product 9.5,PGP9.5）在人胃癌組織中的表達，并探討其與胃腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移的關系。方法 采用免疫組織化學SP法和Western blot法檢測80例胃癌及8例正常胃組織中PGP9.5的表達。結(jié)果 在80例胃癌組織中有56例（70.0%）表達PGP9.5，而正常胃上皮細胞中無PGP9.5表達； Western blot檢測結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。SP法顯示PGP9.5的表達和胃癌的浸潤深度、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關（P＜0.05），與患者年齡、性別、胃癌的組織學類型及TNM分期無關（Pgt;0.05）。結(jié)論 PGP9.5在胃癌侵襲及轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮重要作用，檢測PGP9.5表達可作為腫瘤組織侵襲胃的一個分子標志物。
目的 探討豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成過程中c-kit及scf mRNA及蛋白的表達變化情況。方法 將20只豚鼠隨機分為2組，分別給予普通飼料及致石飼料，致石周期為6周。RT-PCR檢測膽囊組織中c-kit及scf mRNA的表達情況，Western blot檢測c-kit及scf蛋白的表達情況。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，致石組豚鼠膽囊c-kit mRNA （t=6.985， P＜0.01）和scf mRNA （t=6.028，P＜0.01）的表達量下降。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，致石組豚鼠膽囊c-kit （t=10.256，P＜0.01）及scf蛋白（t=9.586，P＜0.01）表達量下降。結(jié)論 飲食誘導的豚鼠膽囊膽固醇結(jié)石形成過程中，豚鼠膽囊c-kit和scf mRNA及蛋白表達水平均下降。c-kit/scf通路抑制可能參與膽囊膽固醇結(jié)石的形成。
目的 探討NDRG2基因在人原發(fā)性肝細胞肝癌及正常肝組織中的表達及其臨床意義。方法 收集原發(fā)性肝細胞肝癌及正常肝組織標本，采用免疫組化ABC法、Western blot法及Real-time PCR法檢測原發(fā)性肝細胞肝癌及正常肝組織標本中NDRG2蛋白和mRNA的表達情況，并結(jié)合圖像分析，比較兩者表達的差異。結(jié)果 NDRG2蛋白在肝癌組織及正常肝組織中的表達陽性率分別為16.67%（5/30）和100%（30/30），2組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且陽性表達呈現(xiàn)在細胞質(zhì)中，細胞核中未見有表達。圖像分析結(jié)果顯示，NDRG2蛋白在肝癌組織中表達的相對含量為0.029 0±0.005 9，在正常肝組織中為0.109 2±0.002 8，前者低于后者，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Western blot法檢測結(jié)果與免疫組化染色結(jié)果相一致，在肝癌組織及正常肝組織中均檢測到NDRG2蛋白，肝癌組織中NDRG2蛋白相對表達量為1.13±0.15，低于正常肝組織的1.57±0.18（P＜0.05）。Real-time PCR分析結(jié)果顯示肝癌組織中NDRG2mRNA表達量為0.89±0.15，低于正常肝組織的1.48±0.17（P＜0.05），但肝癌Edmondson-Steiner分級的各級肝癌組織之間NDRG2mRNA表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 NDRG2基因在原發(fā)性肝細胞肝癌及正常肝組織中可能存在差異性表達，提示該基因可能參與了肝細胞肝癌的發(fā)生和發(fā)展，但其具體作用及調(diào)控機理有待進一步研究。
目的提高CEA診斷消化道惡性腫瘤的特異性。方法采用ELISA法分別測定消化道良、惡性疾病患者血液、消化液（膽汁、胃液）中CEA含量，進一步應用Western blot半干轉(zhuǎn)移技術區(qū)分CEA及CEA相關物質(zhì)。結(jié)果消化道惡性腫瘤患者消化液中CEA水平明顯高于血液中CEA水平（P＜0.01），消化道良性疾病患者消化液中CEA水平與血液中CEA水平相比差異無統(tǒng)計學意義； 消化道惡性腫瘤患者消化液中CEA水平明顯高于消化道良性疾病患者消化液中CEA水平（P＜0.01），消化道惡性腫瘤患者血液中CEA水平亦明顯高于消化道良性疾病患者血液中CEA水平（P＜0.05）。除4例CEA含量過低（＜5 μg/L）者外所有消化道惡性腫瘤患者消化液經(jīng)Western blot檢測均表現(xiàn)出一條相對分子質(zhì)量為210×103的特異條帶，而消化道良性疾病患者消化液中均不含有該條帶。結(jié)論采用消化液并結(jié)合Western blot技術可提高CEA診斷消化道惡性腫瘤的特異性。
本研究旨在通過優(yōu)化人β2微球蛋白在大腸桿菌中的表達條件并對重組蛋白進行純化,以期獲得可溶性好、純度高的重組人β2微球蛋白(rhβ2M)。通過檢測誘導劑IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間對rhβ2M可溶性表達的影響,確定最佳的誘導條件為IPTG終濃度0.8 mmol/L,誘導溫度25℃,誘導時間6 h。在最佳誘導條件下進行發(fā)酵培養(yǎng),獲得可溶性rhβ2M占菌體總可溶蛋白含量的63.7%。對可溶性蛋白進行Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析純化,可獲得純度達95%以上的rhβ2M。Western blot分析表明,該蛋白具有與抗人β2M抗體特異反應的抗原特性。