目的 設(shè)計(jì)、構(gòu)建并篩選出轉(zhuǎn)染至人骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901，對(duì)c-myc 沉默效果最佳的復(fù)制缺陷型重組腺病毒質(zhì)粒pAd-c-myc- 短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）包裝出表達(dá)c-myc-shRNA 的重組腺病毒，并測(cè)定其滴度。 方法 設(shè)計(jì)有shRNA 結(jié)構(gòu)的3 對(duì)單鏈寡核苷酸（ss oligos），經(jīng)變性退火為雙鏈寡核苷酸（ds oligos），插入穿梭質(zhì)粒pENTR/U6 載體，測(cè)序正確后，經(jīng)LipofectamineTM2000 陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)入人骨肉瘤細(xì)胞系OS-9901，采用RTPCR篩選對(duì)c-myc 沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pENTR/U6-shRNA，然后與腺病毒骨架質(zhì)粒行同源重組，篩選出正確重組子。采用293A 細(xì)胞包裝出表達(dá)c-myc-shRNA 的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，觀察其細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），采用病毒顆粒法（viral particles，VP）和50% 組織培養(yǎng)感染劑量法（50% tissue culture infective dose，TCID50）測(cè)定病毒滴度。 結(jié) 果 電泳驗(yàn)證后的ds oligos 插入穿梭質(zhì)粒pENTR/U6 載體，測(cè)序結(jié)果提示構(gòu)建的pENTR/U6-shRNA 質(zhì)粒正確。從3 對(duì)ds oligos 通過(guò)RT-PCR 方法篩選出對(duì)c-myc 沉默效果最佳的穿梭質(zhì)粒pENTR/U6-shRNA，經(jīng)Pac Ⅰ酶切線性化后同源重組成功構(gòu)建了介導(dǎo)c-myc-shRNA 復(fù)制缺陷型重組腺病毒，CPE 和空泡現(xiàn)象 3 d 開始出現(xiàn)，6 d 更加明顯。采用VP法測(cè)定的第1 代腺病毒滴度為5.23 × 109 VP/mL，經(jīng)3 ～ 4 代擴(kuò)增后可達(dá)2.26 × 1012 VP/mL。TCID50 證實(shí)病毒滴度為10-3.8/0.1 mL。 結(jié)論 通過(guò)RNA 干擾技術(shù)，體外成功構(gòu)建了介導(dǎo)shRNA-c-myc 復(fù)制缺陷型重組腺病毒。
目的 構(gòu)建沉默環(huán)氧化酶-2（COX-2）基因重組慢病毒，觀察其體外侵襲的抑制作用，從而探討干擾COX-2抑制喉癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)理，為喉癌的治療提供新的思路。 方法 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)COX-2基因在人表皮樣喉癌細(xì)胞（Hep-2）中的表達(dá)情況。利用上海吉?jiǎng)P公司RNA干擾（RNAi）慢病毒表達(dá)載體系統(tǒng)，構(gòu)建針對(duì)COX-2基因慢病毒RNAi表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，干擾COX-2基因的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)干擾前后基因表達(dá)變化。利用生長(zhǎng)曲線測(cè)定干擾載體轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞生長(zhǎng)速度變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期。Boyden侵襲小室法測(cè)定體外侵襲力。 結(jié)果 成功構(gòu)建了COX-2慢病毒RNAi表達(dá)載體，并建立了干擾COX-2基因的Hep-2細(xì)胞系。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)COX-2基因在Hep-2細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)被顯著抑制。生長(zhǎng)曲線測(cè)定，COX-2基因干擾后細(xì)胞增殖明顯變慢。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期可見干擾組誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡，轉(zhuǎn)染G0～G1期細(xì)胞數(shù)量明顯上升，S期細(xì)胞減少，表明siRNA干擾Hep-2細(xì)胞后，細(xì)胞由G0～G1期進(jìn)入到S期受到阻滯，細(xì)胞增殖速度下降。體外侵襲實(shí)驗(yàn)中，Hep-2-AS侵襲細(xì)胞數(shù)（31.0 ± 1.8）顯著低于Hep-2細(xì)胞（104.0 ± 2.6）及Hep-2-P細(xì)胞（99.0 ± 2.7），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 喉癌中過(guò)表達(dá)的COX-2基因被干擾后表達(dá)明顯降低并顯著抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和侵襲能力。同時(shí)驗(yàn)證了COX-2基因RNA干擾在進(jìn)行抗腫瘤的治療中潛在的應(yīng)用前景。
目的 采用RNA干擾技術(shù)沉默CCS（copper chaperone for SOD1）基因，構(gòu)建相關(guān)小干擾RNA（siRNA），探索出針對(duì)CCS的高效siRNA序列。 方法 合成用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞中沉默CCS基因的siRNA。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法在HUVEC細(xì)胞中對(duì)CCS基因進(jìn)行RNA沉默。蛋白免疫印跡Western blotting檢測(cè)沉默前后CCS蛋白表達(dá)變化的情況，甲基四唑藍(lán)法MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞活力。最后用單因素方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以確定有效的siRNA序列。 結(jié)果 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)無(wú)肉眼可見變化，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力分別為98.5%和98.8%。CCS蛋白沉默率分別為63.7%和61.4%。 結(jié)論 采用siCCS-2和siCCS-3序列轉(zhuǎn)染條件對(duì)HUVEC細(xì)胞活力損傷小，CCS沉默效率高，實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定，重復(fù)性好。為我們繼續(xù)研究沉默CCS后抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、血管形成提供了穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的探索以小干擾RNA（siRNA）慢病毒干擾載體組建的慢病毒對(duì)人HepG2細(xì)胞分化抑制蛋白1（Id1）基因的沉默效應(yīng)。 方法構(gòu)建4種針對(duì)Id1基因不同干擾靶點(diǎn)的Id1-siRNA慢病毒干擾載體（pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4），將其轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，以篩選出針對(duì)Id1基因的最有效的RNA干擾（RNAi）靶序列。再以沉默效果最優(yōu)的干擾載體進(jìn)一步構(gòu)建慢病毒（Id1-RNAi-LV），感染人HepG2細(xì)胞后，采用實(shí)時(shí)定量PCR法和Western blot法分別檢測(cè)其Id1 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果與pCGSIL-GFP-Id1-1組、pCGSIL-GFP-Id1-2組及pCGSIL-GFP-Id1-3組比較，pCGSIL-GFP-Id1-4組的Id1蛋白表達(dá)水平最低（P＜0.05），沉默效果最優(yōu)。以pCGSIL-GFP-Id1-4干擾載體組建慢病毒后，測(cè)得慢病毒的病毒滴度為2.0×109 TU/mL。與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，以組建的慢病毒感染人HepG2細(xì)胞后，人HepG2細(xì)胞中Id1 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的特異性慢病毒可穩(wěn)定地介導(dǎo)Id1基因的沉默。
目的觀察探討鈣結(jié)合蛋白S100A4基因靜默對(duì)氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管(RNV)的抑制作用及其機(jī)制。 方法7日齡C57BL/6J小鼠150只隨機(jī)分為正常組、正常-病毒對(duì)照組、單純模型組、基因治療組、空白載體組, 每組30只。正常組、正常-病毒對(duì)照組小鼠在常氧環(huán)境下飼養(yǎng); 其余3組小鼠建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型。小鼠12日齡時(shí), 基因治療組及空白載體組小鼠雙眼玻璃體腔注射病毒滴度為1.0×109 PFU/ml的攜帶針對(duì)S100A4小干擾RNA的重組腺病毒載體(Ad-S100A4-RNAi)和帶綠色熒光蛋白的空白腺病毒載體各1.0μl; 正常-病毒對(duì)照組小鼠玻璃體腔注射同樣滴度的等量Ad-S100A4-RNAi。正常組及單純模型組小鼠不做任何處理。小鼠15日齡時(shí), 基因治療組和正常組作視網(wǎng)膜組織冰凍切片觀察病毒轉(zhuǎn)染情況。小鼠17日齡時(shí), 各組作視網(wǎng)膜組織切片, 計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核; 作全視網(wǎng)膜鋪片免疫熒光染色, 觀察視網(wǎng)膜血管變化; 蛋白免疫印跡法(Western blot)及實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜S100A4、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、半胱天冬酶(Caspase)-3及環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的蛋白和mRNA表達(dá)。 結(jié)果熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 正常組小鼠視網(wǎng)膜未見病毒綠色熒光, 僅可見少量自身熒光; 基因治療組小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外叢狀層可見病毒綠色強(qiáng)熒光, 外核層可見少量弱熒光。單純模型組突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)較正常組明顯增加, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.68, P＜0.05);基因治療組突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核計(jì)數(shù)較單純模型組、空白載體組明顯下降, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.61、14.64, P＜0.05)。與單純模型組、空白載體組比較, 基因治療組小鼠RNV面積、無(wú)灌注區(qū)面積明顯減少, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot及實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示, 與單純模型組、空白載體組比較, 基因治療組小鼠視網(wǎng)膜S100A4、bcl-2、CREB蛋白及mRNA表達(dá)明顯下調(diào), 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);Caspase-3蛋白及mRNA表達(dá)明顯上調(diào), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論S100A4基因靜默可抑制氧誘導(dǎo)RNV。其機(jī)制可能與S100A4基因靜默下調(diào)bcl-2、CREB表達(dá), 上調(diào)Caspase-3表達(dá)作用有關(guān)。
本文為研究 Snail1 基因?qū)眵[癌細(xì)胞株 Hep-2 緊密連接蛋白表達(dá)及遷移能力的影響，將含有 Snail1 基因的短發(fā)夾 RNA（Sh-RNA）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染喉鱗癌細(xì)胞株 Hep-2，培養(yǎng)出可穩(wěn)定傳代的 Snail1 基因沉默的細(xì)胞（命名為 Sh-snail1 細(xì)胞）。課題組以蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)緊密連接蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 的表達(dá)是否發(fā)生變化。然后設(shè)計(jì)傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力，再以蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞遷移能力密切相關(guān)的 RhoGTP 酶家族重要成員 RhoA、Cdc42 蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果表明，Sh-snail1 細(xì)胞緊密連接關(guān)鍵蛋白 ZO-1、Occludin、Claudin-5 表達(dá)明顯上調(diào)，遷移能力明顯減弱，且 RhoA、Cdc42 蛋白表達(dá)下調(diào)。該研究表明，喉鱗癌 Hep-2 細(xì)胞通過(guò)下調(diào) Snail1 基因的表達(dá)使細(xì)胞間連接更加緊密，同時(shí)抑制 Hep-2 細(xì)胞的遷移能力，下調(diào) RhoA、Cdc42 蛋白的表達(dá)。本文研究結(jié)果證實(shí)，Snail1 基因與 Hep-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中的細(xì)胞間緊密連接打開以及細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)密切相關(guān)，為靶向治療喉鱗癌提供分子機(jī)制的研究依據(jù)。
目的探討小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）慢病毒介導(dǎo)沉默 P75 神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（P75 neurotrophin receptor，P75NTR）基因?qū)Υ笫?BMSCs 成骨分化的影響。方法首先設(shè)計(jì) 3 條慢病毒介導(dǎo) P75NTR 基因的 siRNA 序列（P75NTR-siRNA-1、2、3）以及陰性對(duì)照（negative control，NC）-siRNA，分別轉(zhuǎn)染第3 代 SD 大鼠 BMSCs；倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 及 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞 P75NTR 基因及蛋白表達(dá)情況，并篩選沉默效果最佳的 P75NTR-siRNA 進(jìn)行后續(xù)成骨分化實(shí)驗(yàn)。取第 3 代 SD 大鼠 BMSCs，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組；其中，陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組分別采用 NC-siRNA 及篩選的 P75NTR-siRNA 慢病毒載體轉(zhuǎn)染 BMSCs，空白對(duì)照組為正常 BMSCs。采用 MTT 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況；各組細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，Western blot 檢測(cè)成骨相關(guān)蛋白［骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）及 Runx 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（Runx related transcription factor 2，Runx2）］表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色觀察Ⅰ型膠原表達(dá)情況，ALP 檢測(cè)以及茜素紅染色觀察成骨情況。結(jié)果慢病毒介導(dǎo) P75NTR 基因轉(zhuǎn)染 BMSCs 后，其 P75NTR mRNA 及蛋白表達(dá)量均明顯降低（P<0.05），其中 P75NTR-siRNA-3 沉默效果最佳。P75NTR 基因沉默后，MTT 檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖較兩對(duì)照組明顯增快（P<0.05）。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組 OCN 及 Runx2 蛋白相對(duì)表達(dá)量、Ⅰ 型膠原蛋白表達(dá)、ALP 活力均明顯高于兩對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且隨成骨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，礦化結(jié)節(jié)逐漸增多。結(jié)論siRNA 慢病毒沉默 P75NTR 基因可以促進(jìn)大鼠 BMSCs 成骨分化，為治療骨缺損提供了新思路。