目的 觀察T 淋巴細(xì)胞瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子1 ( Tiam 1) 反義寡核苷酸(ASODN) 轉(zhuǎn)染對(duì)胃癌細(xì)胞形體重塑的影響。方法 采用層粘連蛋白黏附法,由胃癌MKN245 細(xì)胞株(M0 ) 中篩選獲得高侵襲轉(zhuǎn)移亞株(MH ) 。以脂質(zhì)體介導(dǎo)將Tiam 1 ASODN 轉(zhuǎn)染至MH 細(xì)胞中,并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT2PCR) 及流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)Tiam 1 mRNA 和蛋白的表達(dá)。采用HE 染色、細(xì)胞骨架蛋白染色及掃描電鏡技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染MH 細(xì)胞在形態(tài)學(xué)方面的不同。結(jié)果 與未轉(zhuǎn)染組相比,應(yīng)用0. 43μmol/ L Tiam 1 ASODN 轉(zhuǎn)染可特異性抑制胃癌MH細(xì)胞中Tiam 1 mRNA 和蛋白的表達(dá)( Plt; 0. 01) ; 轉(zhuǎn)染MH 細(xì)胞的膜表面突起及偽足變稀疏或縮短,細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂程度降低,斑點(diǎn)狀肌動(dòng)蛋白小體減少。結(jié)論 特異性ASODN 轉(zhuǎn)染可有效抑制Tiam 1 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及胃癌細(xì)胞形體重塑,這可能對(duì)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。
目的 在體外實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步觀察反義硫代磷酸酯寡核苷酸（ASODN）在裸鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細(xì)胞SMMC-7721/ADM多藥耐藥基因mdr1的作用。 方法 取體外培養(yǎng)的耐藥肝癌細(xì)胞（1×107個(gè)/0.2 ml）注射于裸小鼠腋部皮下，建立耐藥肝癌模型，而后將成模裸鼠分成4組，每組各5只。ASODN組在裸鼠腫瘤局部注射濃度為3 μmol/L的ASODN 50 μl和脂質(zhì)體Lipofectamine 50 μl，并在腹腔內(nèi)注射阿霉素(ADM，每天10 mg/m2)； 正義鏈組（SODN組）與ASODN組的方法、劑量相同； 對(duì)照1組、對(duì)照2組分別在裸鼠局部注射Lipofectamine 50 μl和生理鹽水200 μl，同時(shí)腹腔注射ADM(每天 10 mg/m2)。寡核苷酸于觀察的兩周內(nèi)每周前3 d注射； ADM于每周的第2～4天使用。Lipofectamine和生理鹽水使用時(shí)間與寡核苷酸相同。 結(jié)果 隨著時(shí)間的推移，4組裸鼠的腫瘤體積逐漸增大，且于第5天開(kāi)始變化明顯，此后各時(shí)相之腫瘤體積與前一時(shí)相比較，差異均有顯著性意義（P＜0.05）； ASODN組的腫瘤體積在第5天后明顯小于其他3組（P＜0.05）； 而對(duì)照1組、對(duì)照2組及SODN組各時(shí)相的腫瘤體積差異無(wú)顯著性意義（Pgt;0.05）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SODN及脂質(zhì)體對(duì)裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，而ASODN對(duì)裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。 結(jié)論 ASODN在體內(nèi)同樣可逆轉(zhuǎn)SMMC-7721/ADM細(xì)胞的耐藥性,使腫瘤在一定時(shí)間內(nèi)處于生長(zhǎng)相對(duì)緩慢狀態(tài)。
目的觀察脂質(zhì)體介導(dǎo)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。 方法根據(jù)PCNA cDNA序列設(shè)計(jì)合成與PCNA mRNA AUG起始密碼子后的18位堿基序列互補(bǔ)的PCNA反義寡核苷酸，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株，通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定，MTT比色法檢測(cè)PCNA反義寡核苷酸對(duì)人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，比較陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法與直接轉(zhuǎn)染法的區(qū)別。 結(jié)果PCNA反義寡核苷酸作用后的肝癌細(xì)胞，生長(zhǎng)明顯受到抑制。應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染能顯著提高PCNA反義寡核苷酸的抑增殖效應(yīng)。結(jié)論利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PCNA反義寡核苷酸能顯著提高對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)。
目的 研究反義硫代磷酸寡核苷酸(AS-ODN)抑制人肝癌細(xì)胞耐藥株(SMMC-7721／ADM)MRP基因表達(dá)的作用。方法 用人工合成互補(bǔ)于MRP基因mRNA特定片斷的反義硫代磷酸寡核苷酸，以脂質(zhì)體Lipofectamine為載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721／ADM細(xì)胞株，用RT-PCR測(cè)定mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞膜MRP1蛋白P190表達(dá)及MTT法檢測(cè)細(xì)胞對(duì)柔紅霉素(DNR)和阿霉素(ADM)的敏感性。 結(jié)果 AS-ODN能抑制MRP mRNA和其蛋白P190表達(dá)，提高細(xì)胞對(duì)DNR和ADM的敏感性。 結(jié)論 ①AS-ODN能降低MRP基因表達(dá)； ②MRP介導(dǎo)的多藥耐藥(MDR)是SMMC-7721／ADM耐藥的重要機(jī)理之一。
目的 觀察反義硫代磷酸寡核苷酸（ASOND）逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細(xì)胞的多藥耐藥作用。方法 用人工合成互補(bǔ)于mdrl基因5′端AUG起始密碼子的反義20聚硫代磷酸寡核苷酸，以L(fǎng)ipofectamine為載體，轉(zhuǎn)染人耐藥肝癌細(xì)胞SMMC-7721，MTT測(cè)定細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞儀分析P-170的表達(dá)。結(jié)果 ASOND可抑制SMMC-7721細(xì)胞mRNA及P-170的表達(dá)，增加耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，最佳ASOND作用濃度為0.5μmol/L。結(jié)論 ASOND可增加耐藥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)耐藥肝癌細(xì)胞耐藥。
目的 探討核因子κB 圈套寡核苷酸( NF-κB decoy ODN) 轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠成熟樹(shù)突狀細(xì)胞( DCs) 生物學(xué)特性的影響。方法 體外誘導(dǎo)Balb/c 小鼠骨髓細(xì)胞生成未成熟DCs( imDCs) , 經(jīng)抗原 OVA 以及LPS孵育后成為OVA 沖擊的骨髓來(lái)源成熟DCs( mDCs) , 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCs 表面分子CD11c 以及MHC-Ⅱ的表達(dá)予以鑒定; 將NF-κB decoy ODN 體外轉(zhuǎn)染小鼠骨髓來(lái)源成熟DCs, 同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組( 轉(zhuǎn)染NF-κB“變異”O(jiān)DN) 以及未轉(zhuǎn)染組, EMSA 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NF-κB 的活性變化; 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DCs 表面共刺激分子( CD40、CD80、CD86) 的表達(dá); 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)觀察各組DCs 對(duì)OVA 致敏的T淋巴細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果 成功培養(yǎng)出骨髓來(lái)源成熟DCs; NF-κB decoy ODN 轉(zhuǎn)染DCs 的NF-κB活性明顯降低( P lt;0. 05) , DCs 表面CD40、CD80 共刺激分子的表達(dá)與陰性對(duì)照組、未轉(zhuǎn)染組比較無(wú)明顯改變( P gt; 0. 05) , 而CD86 的表達(dá)與其他各組比較明顯降低( P lt;0. 05) ; 在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中,NF-κB decoy ODN轉(zhuǎn)染DCs 對(duì)T細(xì)胞的增殖有抑制作用( P lt; 0.05) , 而陰性對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組的DCs具有強(qiáng)烈的激發(fā)T細(xì)胞增殖的能力( P lt; 0. 05) 。結(jié)論 NF-κB decoy ODN 轉(zhuǎn)染DCs 可能通過(guò)CD86 的表達(dá)降低顯著抑制抗原特異性T細(xì)胞活化, 該改良的DCs 有可能用于哮喘的免疫治療。
目的采用可溶性支架將原癌基因c—myc反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染靜脈移植物，觀察其對(duì)靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白和增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白產(chǎn)物表達(dá)的影響。方法50只新西蘭大耳白兔建立兔頸外靜脈頸總動(dòng)脈旁路移植模型后隨機(jī)分成5組，每組10只。對(duì)照組：無(wú)支架；組1：植入單純可溶性支架；組2：植入正義c—myc寡核苷酸可溶性支架；組3：植入反義c—myc寡核苷酸可溶性支架；組4：植入不匹配c—myc寡核苷酸可溶性支架。于靜脈移植后7d、28d和90d取出靜脈移植物，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)其c—myc蛋白和PCNA蛋白的表達(dá)。結(jié)果對(duì)照組、組1、組2、組4靜脈移植術(shù)后7d、28d、90d時(shí)靜脈移植物內(nèi)膜和中膜內(nèi)可見(jiàn)大量c—myc蛋白和PCNA蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞，與同時(shí)間點(diǎn)組3比較差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0．01）。28d、90d時(shí)5組靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白的表達(dá)與同組7d時(shí)比較明顯增強(qiáng)（P〈0．01）。結(jié)論可溶性支架轉(zhuǎn)染c—myc反義寡核苷酸可顯著抑制靜脈移植物內(nèi)c—myc蛋白和PCNA蛋白的表達(dá)。
目的 人Ⅰ型前膠原基因（Col Ⅰ A1）反義寡核苷酸（antisense oligodeoxyneucleotide，ASODN）對(duì)體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞有抑制膠原合成作用，擬進(jìn)一步探討Col Ⅰ A1 ASODN 對(duì)裸鼠移植模型體內(nèi)的人增生性瘢痕的膠原合成作用。 方法 SPF 級(jí)BALB/c-nunu 品系6 ～ 8 周齡雌性裸鼠60 只，體重約20 g；取行瘢痕切除手術(shù)患者自愿捐贈(zèng)的瘢痕組織塊去表皮后，移植至裸鼠背部肩胛內(nèi)側(cè)皮下，每只裸鼠移植1 塊，制備人增生性瘢痕裸鼠移植模型。將58 只成功制備模型的裸鼠根據(jù)處理方法不同，隨機(jī)分成3 組，于瘢痕移植2 周根據(jù)分組行經(jīng)皮穿刺瘢痕內(nèi)注射。A 組（n=20）：5 μL 濃度為3 mmol/L Col Ⅰ A1 ASODN、3 μL 脂質(zhì)體、92 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基；B 組（n=20）： 3 μL 脂 質(zhì)體、97 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基；C 組（n=18）：100 μL Opti-MEM Ⅰ減血清培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)最初2 周每天注射1 次，之后隔天1 次，至實(shí)驗(yàn)取材。注射后2、4、6 周，對(duì)存活裸鼠進(jìn)行瘢痕硬度測(cè)量后，處死裸鼠取瘢痕組織行膠原染色組織學(xué)觀察以及透射電鏡觀察；提取細(xì)胞總RNA 后行RT-PCR 測(cè)定Col Ⅰ A1 mRNA 相對(duì)含量；ELISA 法行Col Ⅰ A1 蛋白定量分析。 結(jié)果 注射后6 周內(nèi)17 只裸鼠死亡；共41 只裸鼠40 塊瘢痕組織符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，納入實(shí)驗(yàn)；A、B、C 組各14、13、14 只。注射后2 周，3 組間瘢痕硬度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；4、6 周時(shí)A 組與B、C 組比較， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。隨時(shí)間延長(zhǎng)，組織學(xué)觀察示3 組Ⅲ型膠原表達(dá)上升，A 組最明顯，Ⅰ型膠原排列規(guī)則。透射電鏡觀察示A 組成纖維細(xì)胞退化，膠原纖維排列更趨于一致；B、C 組膠原纖維排列也逐漸規(guī)則。注射后2、4 周3 組間Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；6 周時(shí)A 組與B、C 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 在人增生性瘢痕裸鼠移植模型的瘢痕內(nèi)注射Col Ⅰ A1 ASODN 可抑制Col Ⅰ A1 mRNA 及Ⅰ型膠原表達(dá)，促進(jìn)瘢痕組織成熟、軟化，脂質(zhì)體可促進(jìn)該抑制效果。
探討陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)Ⅰ 型前膠原基因（Col Ⅰ A1）反義寡核苷酸（antisense oligodeoxyneucleotide，ASODN）轉(zhuǎn)染對(duì)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞Col Ⅰ A1 表達(dá)的影響。 方法 取患者自愿捐贈(zèng)瘢痕組織，采用組織塊法培養(yǎng)人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞并傳代。于6 孔板內(nèi)按32.25 × 104 個(gè)/ 孔的密度接種第4 代細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染液不同分為4 組：A 組為脂質(zhì)體加Col Ⅰ A1 ASODN，B 組為Col Ⅰ A1 ASODN，C 組為脂質(zhì)體，D 組為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后8 h，1、2、3、4 d 分別提取細(xì)胞總RNA，行RT-PCR 后測(cè)定Col Ⅰ A1 mRNA 表達(dá)量；胃酶消化法提取ECM 中Col Ⅰ A1 蛋白，ELISA 測(cè)定其濃度。 結(jié)果 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示條帶清晰，無(wú)雜帶、明顯的引物二聚體及拖尾現(xiàn)象。Col Ⅰ A1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量：轉(zhuǎn)染后8 h，A 組小于B、C、D 組，B、C 組小于D 組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；B、C 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后1 d，A、B 組小于C、D 組（P lt; 0.05），A、B 組間和C、D 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05） ；轉(zhuǎn)染后2 d，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后3、4 d，A 組小于B、C、D 組，B 組小于C、D 組（P lt; 0.05），C、D 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。Col Ⅰ蛋白濃度：轉(zhuǎn)染后8 h，A組小于B、C、D 組，B、C 組小于D 組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PP gt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后1 d，各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后2、3、4 d，A、B 組小于C、D 組，C 組小于D 組（P lt; 0.05），A、B 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 Col Ⅰ A1 ASODN 抑制Col Ⅰ A1 mRNA 和蛋白表達(dá)；陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為載體有增強(qiáng)效果，促進(jìn)ASODN 進(jìn)入細(xì)胞并在核內(nèi)分布。
目的 探討殼聚糖納米粒子攜帶反義基因在血管外科領(lǐng)域中的 應(yīng)用。方法 雄性SPF級(jí)SD大白鼠54只，體重450~600g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn) 組和對(duì)照組（n＝27）。實(shí)驗(yàn)組取右側(cè)頸靜脈、頸動(dòng)脈吻合口段灌注攜帶增殖細(xì)胞核抗 原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)的反義寡核苷酸（antisens oligo deoxy nucleotides, ASODN ）粒子后，移植至同側(cè)頸動(dòng)脈；對(duì)照組用同樣方法灌注生理鹽水。取 造模后血管通暢的48只大白鼠(n=24)分別于第1、2、3、4周超聲多普勒監(jiān)測(cè)血流動(dòng)力學(xué) ，取標(biāo)本行免疫組織化學(xué)染色、Western blot蛋白印跡檢測(cè)、血管壁組織病理變化檢測(cè)等。 結(jié)果兩組的血栓形成率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。在4 周的觀察期內(nèi)，代表增殖的PCNA蛋白印跡條帶顯示：實(shí)驗(yàn)組移植靜脈、吻合口的濃度較對(duì)照 組低。術(shù)后1、2、3及4周，實(shí)驗(yàn)組移植靜脈PCNA陽(yáng)性細(xì)胞指數(shù)分別為0.13％±0.11％，0. 79％±0.28％，0.45％±0.29％,0.43％±0.25％，吻合口分別為1.90％±0.84％ ，2.11％±0.98％，2.48％±0.77％，2.17％±0.36％，較對(duì)照組明顯減少（P＜ 0.05）；實(shí)驗(yàn)組移植靜脈及吻合口的空腔面積分別為88.71±16.96、95.98±21.44 、88.48±32.81、97.86±34.11 μm2和41.49±3.34、45.15±11.65、46.27± 8.90、51.62±8.85 μm 2，均較對(duì)照組大（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組移植靜脈、吻合口的內(nèi)膜面積／中膜面積分別為22.73％±3.11％、32.40％±4.55％、45.14％±3.19％、45.70％±5.01％和41.49％±3.34％、45.15％±11.65％、46.27％±8.90％ 、51.62％±8.85％，均較對(duì)照組?。≒＜0.05）。最大血流速度比較，兩組在第1周血流最大速度相似，后3周出現(xiàn)不同變化。對(duì)照組靜脈移植段和吻合口的最大流速逐漸增加，在第3周達(dá)到最高，至第4周時(shí)降低；實(shí)驗(yàn)組靜脈移植段和吻合口最大流速逐漸降低，在第3周達(dá)到最低，至第4周時(shí)升高。第4周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組移植靜脈段和吻合口最大流速均接近 。各時(shí)間點(diǎn)兩組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 殼聚糖納米粒子攜帶PCNAASODN能有效抑制血管移植后內(nèi)膜細(xì)胞增殖，從而抑制新生內(nèi)膜過(guò)度增厚。