目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）體內(nèi)誘導(dǎo)成骨及成血管的活性，為股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head，ANFH）的AAV 基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法 取體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，分別采用以下4 種病毒轉(zhuǎn)染并分為4 組：rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）-hBMP-7（A 組）、rAAV-hVEGF165- 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（B 組）、rAAV- hBMP-7-GFP（C 組）及rAAV-IRES-GFP（D 組）。取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作后肢缺血模型，并隨機(jī)分為4 組（n=6），于股骨肌肉內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應(yīng)用超聲影像學(xué)檢測(cè)兔后肢脛前動(dòng)脈血流量，行CD34 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)微血管生成。另取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作股骨肌袋模型，并隨機(jī)分為4 組（n=6），于肌袋內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應(yīng)用X 線片檢測(cè)兔后肢原位骨化，行von Kossa 鈣鹽染色檢測(cè)肌肉組織成骨礦化。 結(jié)果 病毒注射后動(dòng)物未出現(xiàn)局部或全身毒性反應(yīng)。病毒注射后8 周，A 組兔后肢脛前動(dòng)脈血流百分比及CD34 陽(yáng)性微血管數(shù)均高于其他3 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；B 組高于C、D 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；C、D 組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。病毒注射后8 周，A、C 組兔后肢肌袋內(nèi)出現(xiàn)可被X 線檢測(cè)到的原位骨化，von Kossa 肌肉組織鈣鹽染色可見大量鈣鹽沉積，且A 組原位骨化及鈣鹽沉積程度均較C 組強(qiáng)；B 組及D 組均未見明顯原位骨化及鈣鹽沉積形成。 結(jié)論 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 載體具有體內(nèi)誘導(dǎo)成骨及成血管的生物學(xué)活性。
目的確定2個(gè)Alstr?m綜合征（ALMS）家系的致病基因變異。方法回顧性臨床研究。2020年8月至2021年12月于河南省立眼科醫(yī)院就診的2個(gè)ALMS家系的2例患者（先證者）及其家系成員5名納入研究。患者分別來(lái)自2個(gè)無(wú)血緣關(guān)系家系。詳細(xì)詢問(wèn)病史和家族史，并行最佳矯正視力、屈光度、眼底彩色照相、色覺、光相干斷層掃描（OCT）、全視野視網(wǎng)膜電圖（ff-ERG）檢查。采集受試者外周靜脈血5 ml，提取全基因組DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，采用聚合全外顯子探針進(jìn)行捕獲。對(duì)于可疑的致病突變位點(diǎn)，通過(guò)Sanger進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)用分析軟件對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果家系1先證者，男，4歲。雙眼自幼畏光伴視力低下。雙眼紅、綠色盲。雙眼眼前節(jié)及眼底未見明顯異常。OCT檢查，雙眼黃斑區(qū)橢圓體帶及嵌合體帶模糊、欠清晰。ff-ERG檢查，雙眼視錐系統(tǒng)功能嚴(yán)重受損，視桿系統(tǒng)功能輕度受損。家系2先證者，女，12歲。雙眼自幼畏光伴視力低下。雙眼紅、綠色盲。雙眼眼前節(jié)未見明顯異常。雙眼視網(wǎng)膜大量色素沉著，黃斑中心凹反光不清。OCT檢查，雙眼神經(jīng)視網(wǎng)膜外層結(jié)構(gòu)紊亂、變薄，累及黃斑中心凹，視網(wǎng)膜色素上皮粗糙。ff-ERG檢查，雙眼視錐、視桿系統(tǒng)功能均嚴(yán)重受損?；驒z測(cè)結(jié)果顯示，家系1先證者ALMS1基因存在c.468dupT（M1）移碼變異和c.10819C>T（M2）無(wú)義變異，均為新發(fā)變異。家系2先證者ALMS1基因存在c.2296_2299del（M3）、c.10831_10832del（M4）移碼變異。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，M1、M3變異為可能致病的變異；M2、M4變異為致病的變異。結(jié)論ALMS1基因M1、M2和M3、M4分別可能是家系1和家系2的致病基因變異；M1、M2為新發(fā)突變位點(diǎn)。
目的 探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在大鼠激素性股骨頭缺血性壞死（steroid-induced avascular necrosis of femoral head，SANFH）中的作用。 方法 12月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量 200～230 g，隨機(jī)分為對(duì)照組（A組，n=24）、模型組（B組，n=24）和干預(yù)組（C組，n=24）。B、C組大鼠采用脂多糖聯(lián)合甲潑尼龍法制備SANFH模型；C組在第1次注射甲潑尼龍時(shí)開始肌肉注射人重組分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（secreted frizzled related protein 1，SFRP1）[1 μg/（kg·d）]，持續(xù)30 d。A組于B組各注射時(shí)間點(diǎn)同法給予等量生理鹽水。觀察B、C組動(dòng)物造模期間以及造模后一般情況。于末次注射甲潑尼龍后2、4、8 周，各組取8只動(dòng)物雙側(cè)股骨頭標(biāo)本行HE染色并計(jì)算空骨陷窩率，TUNEL染色并計(jì)算細(xì)胞凋亡率，免疫組織化學(xué)染色及Western blot 檢測(cè)活性β-catenin、c-Myc表達(dá)情況。 結(jié)果 B、 C組造模期間共6只動(dòng)物死亡，均對(duì)應(yīng)補(bǔ)充；其余動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成。組織學(xué)觀察示，A組為正常骨組織結(jié)構(gòu)；B、C組隨時(shí)間延長(zhǎng)均出現(xiàn)骨質(zhì)紊亂、骨小梁斷裂等骨壞死表現(xiàn)。各時(shí)間點(diǎn)C組空骨陷窩率及細(xì)胞凋亡率均高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。免疫組織化學(xué)染色及Western blot檢測(cè)示，各時(shí)間點(diǎn)C組活性β-catenin及c-Myc表達(dá)水平均低于A、B組，B組低于A組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常參與了大鼠SANFH早期病變，作用機(jī)制可能與其調(diào)控c-Myc表達(dá)，導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。
目的確定1個(gè)漢族Leber先天性黑矇（LCA）家系的致病基因突變。方法回顧性研究。2018年10月在河南省立眼科醫(yī)院就診的LCA一家系1例患者和3名家系成員納入研究。詳細(xì)詢問(wèn)患者病史并行物體注視性質(zhì)、追隨試驗(yàn)、裂隙燈顯微鏡、散瞳驗(yàn)光、眼底照相及全視野ERG檢查；家系成員行BCVA、裂隙燈顯微鏡聯(lián)合前置鏡、驗(yàn)光、眼底照相及全視野ERG檢查。采集先證者及其兄長(zhǎng)、父母的外周靜脈血5 ml，提取全基因組DNA。應(yīng)用包含441個(gè)致病基因的遺傳眼病捕獲芯片進(jìn)行靶向捕獲富集高通量測(cè)序以獲得致病基因及突變。對(duì)可疑致病突變位點(diǎn)通過(guò)Sanger進(jìn)行驗(yàn)證，并行生物信息學(xué)分析確定基因突變位點(diǎn)的致病性。結(jié)果患者表現(xiàn)為自幼不追物但有明顯畏光和眼球震顫；雙眼眼前節(jié)及眼底無(wú)異常；全視野ERG檢查可見雙眼視錐、視桿系統(tǒng)功能嚴(yán)重下降?；驒z測(cè)結(jié)果顯示，患者RPGRIP1基因存在c.1635dupA和c.3565C＞T兩個(gè)突變。其中，RPGRIP1 c.1635dupA為新發(fā)突變。RPGRIP1基因c.1635dupA和c.3565C＞T構(gòu)成復(fù)合雜合突變。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，c.3565C＞T為致病突變，c.1635dupA為可能致病突變。結(jié)論RPGRIP1基因新發(fā)突變c.1635dupA與c.3565C＞T構(gòu)成復(fù)合雜合突變可能是本家系的致病原因。
目的確定早發(fā)性嚴(yán)重視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)不良（EOSRD）一家系的致病基因突變。方法回顧性臨床研究。2018年8月于河南省立眼科醫(yī)院檢查確診的一個(gè)漢族EOSRD家系中1例患者及3名家系成員納入研究。詳細(xì)采集患者病史后，對(duì)受試者行最佳矯正視力（BCVA）、裂隙燈顯微鏡聯(lián)合前置鏡、眼底彩色照相、頻域光相干斷層掃描（SD-OCT）及全視野視網(wǎng)膜電圖（ff-ERG）檢查。采集受試者外周靜脈血5 ml，提取全基因組DNA。應(yīng)用包含441個(gè)致病基因的遺傳眼病捕獲芯片進(jìn)行靶向捕獲富集高通量測(cè)序，對(duì)明確的致病突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證；應(yīng)用分析軟件對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果先證者女，6歲，于1歲以后出現(xiàn)雙眼夜間視力差。雙眼BCVA均為0.1。視盤顏色稍淡；視網(wǎng)膜血管管徑稍變細(xì)，血管弓外視網(wǎng)膜可見廣泛色素改變。SD-OCT檢查可見雙眼黃斑中心凹處外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶結(jié)構(gòu)欠清、斷續(xù)；中心凹外可視區(qū)神經(jīng)上皮外叢狀層、外核層、外界膜、橢圓體帶及嵌合體帶逐漸消失，色素上皮層厚度欠均勻。ff-ERG檢查，雙眼視錐、視桿系統(tǒng)功能嚴(yán)重下降?；驒z測(cè)結(jié)果顯示，先證者Tubby樣蛋白1（TULP1）基因存在c.921C>A純合突變，環(huán)核苷酸門控通道β1（CNGB1）基因存在c.3121C>T、c.3488G>A復(fù)合雜合突變。氨基酸保守性分析結(jié)果顯示，上述3個(gè)突變位點(diǎn)在多個(gè)物種中均高度保守。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，TULP1基因c.921C>A（p.Cys307*）在蛋白質(zhì)保守區(qū)出現(xiàn)翻譯終止，CNGB1基因c.3121C>T（p.Arg1041Trp）、c.3488G>A（p.Gly1163Glu）在蛋白質(zhì)保守區(qū)出現(xiàn)氨基酸極性變化，導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大改變。結(jié)論TULP1基因c.921C>A純合突變、CNGB1基因c.3121C>T和c.3488G>A復(fù)合雜合突變?yōu)樵揈OSRD家系的突變位點(diǎn)。