目的 探討細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA4Ig）融合蛋白對(duì)同種異體肝臟移植免疫耐受的誘導(dǎo)作用及機(jī)理。方法 利用大型哺乳動(dòng)物獼猴作為研究對(duì)象，建立同種異體原位肝臟移植模型。同種異體原位肝臟移植對(duì)照組及CTLA4-Ig組各5只。觀(guān)察術(shù)后生存時(shí)間，檢測(cè)肝功能、IL-2、IL-10、排斥反應(yīng)的病理學(xué)分級(jí)和術(shù)后肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果 對(duì)照組平均存活時(shí)間為6.57 d，CTLA4-Ig組平均存活時(shí)間為14.92 d (Plt;0.05)。肝功能變化: 對(duì)照組術(shù)后ALT明顯升高，Alb則明顯降低; CTLA4-Ig組ALT及Alb均維持于正常穩(wěn)定水平。細(xì)胞因子變化： 術(shù)后3 d起，對(duì)照組循環(huán)血中IL-2表達(dá)水平相對(duì)較高，而CTLA4-Ig組IL-10的表達(dá)水平較對(duì)照組高。移植物病理排斥反應(yīng)分級(jí): 在移植術(shù)后CTLA4-Ig組排斥反應(yīng)程度明顯比對(duì)照組輕。對(duì)照組術(shù)后3 d起肝臟細(xì)胞凋亡指數(shù)較CTLA4-Ig組明顯升高。結(jié)論 CTLA4-Ig融合蛋白可誘導(dǎo)移植后免疫耐受，延長(zhǎng)受體生存時(shí)間。細(xì)胞因子IL-2或者IL-10可作為監(jiān)測(cè)移植排斥反應(yīng)或者免疫耐受的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之一。
目的 探討豬-猴異種血管移植超急性排斥反應(yīng)（HAR）的機(jī)理。方法 豬股靜脈原位異種移植于恒河猴，發(fā)生HAR后通過(guò)免疫組化檢測(cè)移植血管IgG、IgM、C3及C4的沉積。結(jié)果 大量IgM、C3和C4沉積于移植靜脈內(nèi)皮，未發(fā)現(xiàn)IgG沉積于移植血管內(nèi)皮。結(jié)論 豬-猴異種移植HAR是由異種自然抗體IgM與異抗原特異結(jié)合啟動(dòng)，進(jìn)而以經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)而發(fā)生。
作者采用猴制急性壞死性胰腺炎（ANP）模型，觀(guān)察腫瘤壞死因子（TNF）以及生長(zhǎng)抑素對(duì)猴ANP血漿TNF和猴死亡情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：猴ANP早期其血漿TNF明顯升高，與猴死亡呈平行關(guān)系；生長(zhǎng)抑素可明顯降低TNF含量，使猴死亡率下降，存活時(shí)間延長(zhǎng)。提示TNF是AFP早期的重要炎癥介質(zhì)，生長(zhǎng)抑素可明顯抑制炎癥反應(yīng)過(guò)程，對(duì)猴ANP有確切的治療效果。
目的構(gòu)建人膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（human glial cell derived neurotrophic factor，hGDNF）基因修飾的猴雪旺細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系。 方法以pUC19-hGDNF為模板，擴(kuò)增含hGDNF基因序列，將其插入質(zhì)粒pBABE-puro，構(gòu)建pBABE-puro-hGDNF重組真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定及DNA測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒。從恒河猴提取、培養(yǎng)、純化雪旺細(xì)胞。包裝病毒，利用含hGDNF基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot檢測(cè)hGDNF mRNA及蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果PCR產(chǎn)物hGDNF基因編碼序列大小約596 bp。重組表達(dá)載體經(jīng)雙酶切鑒定，含有1 條596 bp的特異性條帶，其基因測(cè)序結(jié)果與基因庫(kù)中hGDNF基因序列片段相同，提示hGDNF基因成功轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)胞hGDNF mRNA及蛋白表達(dá)量顯著高于未轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論成功構(gòu)建hGDNF基因修飾的猴雪旺細(xì)胞穩(wěn)定細(xì)胞系，能長(zhǎng)期穩(wěn)定高效釋放hGDNF，為進(jìn)一步將其應(yīng)用于神經(jīng)損傷修復(fù)奠定了基礎(chǔ)。
目的研究恒河猴BMSCs在缺氧再給氧環(huán)境下對(duì)新生豬胰島活性和功能的保護(hù)作用。 方法取健康成年恒河猴5只，體重6～10 kg，取骨髓采用骨髓單核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法篩選獲得BMSCs；取3～5日齡新生長(zhǎng)白豬5 只，取胰腺以Ⅴ型膠原酶消化制備新生豬胰島。將實(shí)驗(yàn)分為胰島正常組（A組）、胰島加BMSCs正常組（B組）、胰島缺氧再給氧組（C組）、胰島加BMSCs缺氧再給氧組（D組），觀(guān)察比較常規(guī)培養(yǎng)和缺氧（1%O2）12 h再給氧24 h或48 h條件下，胰島的功能活性變化：二乙酸熒光素/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色計(jì)算胰島成活率；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8法檢測(cè)新生豬胰島的代謝活性；膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI標(biāo)記后流式細(xì)胞儀檢測(cè)胰島凋亡率；葡萄糖刺激法分析胰島功能糖刺激指數(shù)（stimulation index，SI）。 結(jié)果C組較A、B組胰島團(tuán)更為分散，死亡細(xì)胞增多；D組較C組胰島團(tuán)完整，成活率更高。A、B、C、D組胰島成活率分別為90.2% ± 9.1%、88.3% ± 5.9%、52.3% ± 12.1%、71.4% ± 11.5%，C、D組顯著低于A(yíng)、B組（P lt; 0.05），D組顯著高于C組（P lt; 0.05）。D組BMSCs以1∶10和1∶20比例與胰島缺氧再給氧共培養(yǎng)后，代謝活性顯著高于C組（P lt; 0.05）。A、B、C、D組胰島凋亡率分別為27.1% ± 3.2%、24.0% ± 1.0%、64.3% ± 1.8%、46.2% ± 1.4%，C、D組顯著高于A(yíng)、B組（P lt; 0.05），但D組顯著低于C組（P lt; 0.05）。各時(shí)間點(diǎn)A、B組SI比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），C組顯著低于A(yíng)、B組（P lt; 0.05），在24 h和72 h時(shí)D組顯著高于C組（P lt; 0.05）。 結(jié)論BMSCs對(duì)缺氧再給氧誘導(dǎo)的新生豬胰島活性和功能損傷具有保護(hù)作用。
目的 建立恒河猴外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）快速有效的分離純化方法。 方法4～5歲健康恒河猴10只，雌性4只，雄性6只，體重5～8 kg；于大隱靜脈抽取外周血，每只抽取8 mL。密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），分別采用非人靈長(zhǎng)類(lèi)Tregs分離試劑盒的生物素標(biāo)記的混合抗體和磁珠標(biāo)記的抗生物素抗體陰性分選，以及大鼠抗人CD4-活化蛋白C（activated protein C，APC）和抗APC多選試劑盒中的磁珠標(biāo)記的抗APC抗體陽(yáng)性分選出 CD4+ T淋巴細(xì)胞，比較兩種方法獲得細(xì)胞的得率、活性及純度；選擇得率、活性和純度較高的分選方法獲得的CD4+ T淋巴細(xì)胞，用磁珠標(biāo)記的抗人CD25抗體進(jìn)行陽(yáng)性分選，獲得 CD4+CD25+ Tregs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)純度、活性及FoxP3表達(dá)水平，以及Tregs對(duì)刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）刺激的自體CD4+CD25-效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞（effective T cells，Teffs）增殖的抑制功能。 結(jié)果CD4+ T淋巴細(xì)胞陽(yáng)性分選和陰性分選后，細(xì)胞活性均達(dá)95%左右，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），但陽(yáng)性分選后CD4+ T淋巴細(xì)胞得率和純度均顯著高于陰性分選（P lt; 0.05）。后續(xù)CD4+CD25+ Tregs分選采用陽(yáng)性分選法獲得的CD4+ T淋巴細(xì)胞。經(jīng)雙陽(yáng)性分選收集的目的細(xì)胞中CD4+CD25+ Tregs占76.2% ± 8.6%，活細(xì)胞比例為93.3% ± 4.7%，F(xiàn)oxP3陽(yáng)性細(xì)胞比例為74.2% ± 6.9%?；旌吓囵B(yǎng)后Tregs均對(duì)ConA刺激的Teffs的增殖有抑制作用。 結(jié)論免疫磁珠雙陽(yáng)性分選法能有效分選出恒河猴外周血中有功能的CD4+CD25+ Tregs。
目的觀(guān)察去細(xì)胞異種神經(jīng)復(fù)合同種異體脂肪干細(xì)胞修復(fù)獼猴周?chē)窠?jīng)缺損后的全身及局部免疫排斥反應(yīng)，評(píng)價(jià)該修復(fù)材料的安全性。 方法健康成年雄性長(zhǎng)白豬1只，體重48 kg，取脛神經(jīng)制備去細(xì)胞異種神經(jīng)；健康成年雄性獼猴1只，體重4.5 kg，分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞；健康成年雌性獼猴10只，體重3～5 kg，制備25 mm長(zhǎng)橈神經(jīng)缺損動(dòng)物模型，隨機(jī)分為復(fù)合細(xì)胞組和無(wú)細(xì)胞組（n=5），前者采用去細(xì)胞異種神經(jīng)復(fù)合第3代脂肪干細(xì)胞移植修復(fù)，后者采用去細(xì)胞異種神經(jīng)移植修復(fù)。于術(shù)前及術(shù)后14、60、90 d抽取外周靜脈血行淋巴細(xì)胞分析；術(shù)后5個(gè)月取材觀(guān)察移植物組織免疫反應(yīng)和神經(jīng)再生情況，并與自體神經(jīng)移植組作比較。 結(jié)果復(fù)合細(xì)胞組與無(wú)細(xì)胞組術(shù)前及術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)外周靜脈血淋巴細(xì)胞數(shù)量、T淋巴細(xì)胞百分率及其數(shù)量、CD8+ T淋巴細(xì)胞百分率、CD4+/CD8+ T淋巴細(xì)胞比值間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；術(shù)后14 d，復(fù)合細(xì)胞組CD4+ T淋巴細(xì)胞百分率低于其余時(shí)間點(diǎn)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；同一時(shí)間點(diǎn)兩組間比較，除術(shù)后14 d復(fù)合細(xì)胞組CD4+ T淋巴細(xì)胞百分率低于無(wú)細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）外，其余各時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。術(shù)后5個(gè)月，去細(xì)胞異種神經(jīng)與周?chē)M織有輕度粘連，神經(jīng)外膜較自體神經(jīng)厚，未見(jiàn)組織壞死、纖維瘢痕形成，移植物內(nèi)見(jiàn)再生神經(jīng)纖維，復(fù)合細(xì)胞組、無(wú)細(xì)胞組均有稀疏的CD3+、CD4+、CD8+、CD68+、CD163+ T淋巴細(xì)胞散在分布，細(xì)胞浸潤(rùn)情況與自體神經(jīng)移植組類(lèi)似。 結(jié)論去細(xì)胞異種神經(jīng)移植修復(fù)獼猴周?chē)窠?jīng)缺損后未產(chǎn)生全身及局部免疫排斥反應(yīng)；復(fù)合同種異體脂肪干細(xì)胞移植后也未發(fā)現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)，且術(shù)后早期可能抑制CD4+ T淋巴細(xì)胞增殖。
目的 探討應(yīng)用幾丁糖/ 聚乙烯醇神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)獼猴周?chē)窠?jīng)缺損的效果。 方法 成年獼猴12 只，雄性5 只，雌性7 只，體重3.26 ～ 5.35 kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成A、B、C 3 組，制備左側(cè)橈神經(jīng)2 cm 缺損模型，分別用幾丁糖/ 聚乙烯醇神經(jīng)導(dǎo)管移植、神經(jīng)切除曠置和自體神經(jīng)逆行原位移植處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右側(cè)為正常對(duì)照。術(shù)后8 個(gè)月，行大體觀(guān)察、組織學(xué)觀(guān)測(cè)及電生理檢測(cè)評(píng)價(jià)神經(jīng)再生效果。 結(jié)果 術(shù)后8 個(gè)月，A 組再生神經(jīng)通過(guò)神經(jīng)導(dǎo)管長(zhǎng)入神經(jīng)缺損的遠(yuǎn)側(cè)端，再生神經(jīng)粘連較輕；B 組未見(jiàn)再生神經(jīng)通過(guò)神經(jīng)缺損斷端；C 組移植神經(jīng)與周?chē)M織粘連較重。A、C 組可檢測(cè)出肌電圖表現(xiàn)，B 組未檢測(cè)到。A、C 組間波幅差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05），但均不及正常對(duì)照側(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；C 組潛伏期和神經(jīng)傳導(dǎo)速度優(yōu)于A(yíng) 組，但均不及正常對(duì)照側(cè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。有髓神經(jīng)纖維密度：A、C 組較正常對(duì)照側(cè)小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；A、C 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。有髓神經(jīng)纖維直徑和髓鞘厚度：C 組優(yōu)于A(yíng) 組，但均不及正常對(duì)照側(cè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt; 0.05）。 結(jié)論 幾丁糖/ 聚乙烯醇神經(jīng)導(dǎo)管具有促進(jìn)獼猴神經(jīng)軸突再生的作用，有望成為自體神經(jīng)替代材料應(yīng)用于周?chē)窠?jīng)缺損修復(fù)。
目的 探討用生物衍生骨材料和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)復(fù)合后構(gòu)成的組織工程化骨對(duì)異體獼猴長(zhǎng)段骨缺損的修復(fù)作用. 方法 于獼猴脛骨結(jié)節(jié)抽取MSCs并使誘導(dǎo)分化為成骨樣細(xì)胞,用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)標(biāo)記,培養(yǎng)后與人源生物衍生骨材料體外復(fù)合構(gòu)成組織工程化骨,植入15只異體獼猴修復(fù)橈骨2.5 cm長(zhǎng)段骨缺損作為實(shí)驗(yàn)組;用單純生物衍生骨材料修復(fù)對(duì)側(cè)同樣骨缺損作為對(duì)照組;另取2只獼猴雙側(cè)橈骨同樣部位和大小骨缺損曠置作為空白組.術(shù)后1、2、3、6和12周時(shí)各處死3只動(dòng)物取材,空白組12周取材,行大體觀(guān)察、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè). 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組術(shù)后1、2和3周移植物周?chē)M織反應(yīng)較明顯,6周后明顯減輕,12周時(shí)基本消失.實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記成骨樣細(xì)胞于術(shù)后6周仍存在,術(shù)后12周基本消失;骨缺損部位骨樣組織、軟骨、編織骨和板層骨出現(xiàn)時(shí)間均較對(duì)照組早,且骨愈合時(shí)間提前3～6周.實(shí)驗(yàn)組骨缺損以多點(diǎn)方式直接成骨,對(duì)照組則從兩端以"爬行替代"方式成骨.空白組術(shù)后12周骨缺損均無(wú)愈合. 結(jié)論 生物衍生骨材料和MSCs復(fù)合構(gòu)建的組織工程化骨異體植入修復(fù)獼猴長(zhǎng)段骨缺損可超越骨段移植的"爬行替代"過(guò)程,使骨缺損能較快愈合.生物衍生骨材料和同種異體MSCs復(fù)合組織工程化骨可作為構(gòu)建骨組織工程的一種較好選擇方式.
目的 建立長(zhǎng)白小家豬到恒河猴異位輔助性肝移植模型，總結(jié)手術(shù)操作要點(diǎn)。方法 以健康雄性長(zhǎng)白小家豬和健康恒河猴各5只建立豬到猴異位輔助性肝移植模型。以長(zhǎng)白小家豬作為肝移植供體，以恒河猴作為受體。保留長(zhǎng)白小家豬的右后葉和部分右前葉作為供肝，移植到受體的左腎窩和左結(jié)腸旁溝處。短暫阻斷受體的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈血流后，將移植肝的門(mén)靜脈和肝下下腔靜脈分別與受體的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈行端側(cè)吻合。結(jié)扎移植肝的肝動(dòng)脈，不予重建。術(shù)后觀(guān)察受體的一般情況和生存時(shí)間。結(jié)果 成功建立4對(duì)肝移植模型，供肝切取時(shí)間24～35min、（30±5） min，供肝修整時(shí)間31～51min、（40±10） min，受體下腔靜脈阻斷時(shí)間23～36min、（30±6） min，受體腹主動(dòng)脈阻斷時(shí)間22～38min、（30±8） min，肝移植手術(shù)時(shí)間130～310min、（220±80） min，術(shù)中失血35～48mL、（42±6） mL。術(shù)后均無(wú)吻合口血栓形成及膽漏發(fā)生。4只受體分別于術(shù)后48、54、88及96h死亡，死亡原因均為排斥反應(yīng)及術(shù)中失血過(guò)多。結(jié)論 豬到猴異位輔助性肝移植模型的可重復(fù)性強(qiáng)、手術(shù)易操作、移植器官灌注良好，可用于豬到非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物肝移植的進(jìn)一步研究。