目的 探討血小板裂解液（platelet lysate，PL）在體外定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord derived mesenchymal stem cells，hUCMSCs）分化成軟骨細胞中的作用。 方法 取健康產(chǎn)婦自愿捐贈臍帶，采用膠原酶消化法分離hUCMSCs，體外培養(yǎng)擴增，流式細胞儀進行細胞表型鑒定。根據(jù)加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分不同將實驗分為以下3 組：A 組為H-DMEM 培養(yǎng)基、10%FBS 及10%PL，B 組為H-DMEM 培養(yǎng)基、10%FBS、10 ng/mL TGF-β1、1 ×10-7 mol/L 地塞米松、50 μg/mL 維生素C 及1% 胰島素鐵硒傳遞蛋白（insulin-transferrin-selenium，ITS），C 組為 H-DMEM培養(yǎng)基、10%FBS、10 ng/mL TGF-β1、1 × 10-7 mol/L 地塞米松、50 μg/mL 維生素C、1%ITS 及10%PL。誘導(dǎo)培養(yǎng)2 周，甲苯胺藍染色檢測各組軟骨細胞基質(zhì)的分泌，免疫熒光檢測軟骨特異性Ⅱ型膠原表達，半定量RT-PCR 檢測蛋白聚糖（Aggrecan）和Ⅱ型膠原表達。 結(jié)果 分離得到的hUCMSCs 不表達造血細胞的表面標記CD45、CD34 和HLA-DR，而表達黏附分子和MSCs 表面標記CD44、CD105 和CD146。甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫熒光染色示C 組呈陽性，B 組呈弱陽性，而A 組均呈陰性。半定量RT-PCR 檢測示Aggrecan 和Ⅱ型膠原在B、C 組中均有表達，A 組中未見表達；C 組Aggrecan mRNA 和Ⅱ型膠原mRNA 表達明顯高于B 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 單純10%PL 不能誘導(dǎo)hUCMSCs 成軟骨分化，但它可當作成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的輔助添加劑，對hUCMSCs 成軟骨分化有明顯促進作用，為構(gòu)建組織工程軟骨提供了新的可利用條件。
目的 探討組織工程骨對大鼠骨缺損的修復(fù)效果。 方法 取16 只成年健康Wistar 大鼠，體重250 ～ 300 g，雌雄不限，制備血小板裂解液（platelet lysate，PL）。將PL、異體脫鈣骨顆粒（allogeneic decalcified bone granules，ADBG）與Col Ⅰ凝膠混合，構(gòu)建PL/ADBG/Col Ⅰ（PAC）及ADBG/Col Ⅰ（AC）。取8 只成年健康Wistar 大鼠，體重250 ～ 300 g，雌雄不限，分離培養(yǎng)BMSCs。取第5 代BMSCs 以1 × 106 個/mL 濃度接種至PAC 復(fù)合培養(yǎng)，體外構(gòu)建組織工程骨（PACB）。另取成年健康Wistar 大鼠40 只，制備雙側(cè)股骨髁缺損模型，隨機分為A、B、C、D 4 組（n=10），分別植入400 mg PACB、PAC、AC 和Col Ⅰ。術(shù)后4 周，行X 線片及組織學觀察、ALP 活性檢測，評價骨缺損修復(fù)效果。 結(jié) 果 術(shù)后4 周，A、B、C、D 組骨密度分別為（7.31 ± 0.54）、（4.36 ± 0.67）、（2.12 ± 0.47）、（1.09 ± 0.55）像素；修復(fù)區(qū)新生骨軟骨和成活的移植骨片總面積分別為（412.82 ± 22.31）、（266.57 ± 17.22）、（94.34 ± 20.22）、（26.12 ± 12.51）像素/ 視野；股骨髁內(nèi)ALP 含量分別為（94.31 ± 7.54）、（69.88 ± 4.12）、（41.33 ± 3.46）、（21.03 ± 3.11）U/L；以上指標A 組均高于B、C、D 組，D 組最低，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。流式細胞儀分析顯示，T 細胞亞群CD3+CD4+CD8-、CD3+CD8+ CD4- 百分比和CD4/CD8 比值在各組間差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 體外構(gòu)建的PACB 可促進大鼠骨缺損修復(fù)。
【摘 要】 目的 觀察血小板裂解液（platelet lysate，PL）對大鼠BMSCs 成骨誘導(dǎo)分化的干預(yù)效應(yīng)。 方法 成年健康清潔級Wistar 大鼠24 只，體重250 ～ 300 g，雌雄不限。取16 只大鼠心內(nèi)采血，采用3 次離心結(jié)合反復(fù)凍融法制備PL，ELISA 法測定PL 中PDGF、TGF-β1、IGF-1 和VEGF 含量。另取8 只大鼠，采用全骨髓分離培養(yǎng)法擴增傳代BM SCs，取第4 代細胞按1 × 104/cm2 接種行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。按誘導(dǎo)培養(yǎng)液的不同，實驗分為3 組，A、B 組基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別含終濃度為5% 和1% 的PL，C 組僅含基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察各組細胞形態(tài)變化及生長狀況；誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，各組行ALP 染色；誘導(dǎo)培養(yǎng)2、8、10 d，ALP/ 總蛋白含量確定ALP 活性；誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d，茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成并定量分析。 結(jié)果 PL 中PDGF、TGF-β1、IGF-1 和VEGF 含量分別為（300 ± 30）、（140 ± 25）、（80 ± 35）和（70 ± 20）pg/mL。倒置相差顯微鏡觀察，各組BMSCs 形態(tài)逐漸發(fā)生改變，出現(xiàn)類成骨細胞樣形態(tài)特征；A 組細胞形態(tài)變化不及B、C 組明顯，但細胞增殖較快；20 d A 組細胞仍密集生長，ECM 中形成的礦物沉積顯著少于B、C 組。誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，A 組細胞胞漿中有少量顆粒，ALP 染色呈弱陽性；B、C 組細胞胞漿中有大量棕褐色顆粒，ALP 染色呈強陽性。誘導(dǎo)培養(yǎng)2、8、10 d，ALP 活性定量分析示A 組顯著低于B 組和C 組（P lt; 0.05）。誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d，茜素紅染色顯示A、B、C 組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量分別為（7.67 ± 1.10）、（12.87 ± 0.81）和（15.59 ± 1.25）個；礦化結(jié)節(jié)面積分別為（161 778.70 ± 44 550.80）、（337 349.70 ± 56 083.24）和（415 921.70 ± 71 725.39）像素；A 組均明顯低于B 組和C 組（P lt; 0.05），B、C 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 PL 是多種生長因子的承載體系，以劑量依賴方式抑制BMSCs 成骨誘導(dǎo)中ALP 活性和礦化結(jié)節(jié)形成。
目的總結(jié)血小板衍生物在組織再生研究與應(yīng)用中的標準化管理方式。方法查閱近年來國內(nèi)外血小板衍生物在組織再生研究與應(yīng)用中出現(xiàn)的瓶頸問題和標準化管理措施的相關(guān)文獻，并進行分析和總結(jié)。結(jié)果盡管血小板衍生物越來越多地用于骨關(guān)節(jié)、皮膚、神經(jīng)、肌腱韌帶、頜面外科等多種組織再生重建研究，但因制備方法差異大、命名不規(guī)范、報告系統(tǒng)不完善以及缺乏制備過程的量化和標準化管理等問題，造成了研究與應(yīng)用結(jié)果的不確定性和不可比性。近年來國際發(fā)展呈現(xiàn)出標準化研究與質(zhì)量管理趨勢。結(jié)論實行標準化研究與質(zhì)量管理將有助于促進血小板衍生物在再生修復(fù)領(lǐng)域的研究與應(yīng)用。