目的 探討人椎間盤細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分子表型差異，分析hBMSCs 經(jīng)TGF-β3 和BMP-7 聯(lián)合誘導(dǎo)后能否分化為軟骨細(xì)胞和髓核細(xì)胞。 方法 取9 例自愿捐贈(zèng)者髂嵴骨髓20 ～ 40 mL 分離培養(yǎng)hBMSCs。取第4 代hBMSCs 行三維微球培養(yǎng)。根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的生長因子不同，實(shí)驗(yàn)分成 4 組，分別為加入10 ng/mL TGF-β3 組（A 組）、200 ng/mL BMP-7 組（B 組）、同時(shí)加入兩種生長因子組（C 組）以及空白對照組（D 組）。于培養(yǎng)后21 d，行組織學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察；于培養(yǎng)后4、21 d 進(jìn)行PCR 檢測Ⅰ、Ⅱ、Ⅹ型膠原、蛋白多糖和SOX9 基因的表達(dá)。 結(jié)果 培養(yǎng)后21 d，HE 染色示A 組和C 組細(xì)胞呈軟骨細(xì)胞樣形態(tài)特征，甲苯胺藍(lán)染色及免疫組織化學(xué)染色Ⅱ型膠原表達(dá)呈陽性。B 組和D 組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，PCR 檢測示培養(yǎng)后21 d，A、C 組SOX9、蛋白多糖、Ⅰ型膠原及Ⅱ型膠原表達(dá)較4 d 時(shí)明顯增加（P lt; 0.05）。B、D 組Ⅰ型膠原表達(dá)較4 d 時(shí)明顯增加（P lt; 0.05），SOX9、蛋白多糖及Ⅱ型膠原較4 d 時(shí)無明顯變化（P gt;0.05）。其中僅A組Ⅹ型膠原表達(dá)呈陽性。 結(jié)論 TGF-β3 和BMP-7 聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)hBMSCs 分化更接近于椎間盤細(xì)胞，可能為椎間盤組織工程提供種子細(xì)胞。
目的 骨再生過程包含一系列復(fù)雜的分子信號途徑，通過探討NF-κB 作為骨折愈合過程中“關(guān)鍵性激活點(diǎn)”的可能性，為基因治療骨折延遲愈合和骨不連提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 取6 ～ 7 周齡Wistar 雄性大鼠33 只，體重180 ～ 220 g，隨機(jī)分為4 組。對照組（A 組，n=3）、單純NF-κB 抑制劑Bay 11-7082 處理組（B 組，n=6）：分別在大鼠右前肢橈骨中下段經(jīng)皮注射0.3 mL 生理鹽水或含50 μmol/L Bay 11-7082 的生理鹽水，每天1 次，持續(xù)至處死。單純骨折組（C 組，n=12）、Bay 11-7082 干預(yù)骨折組（D 組，n=12）：制備右側(cè)橈骨中下段骨折模型后，C 組不作任何處理，D 組處理方法同B 組。觀察大鼠一般情況，A 組于注射后7 d，B、C、D 組于注射后3、7 d 取標(biāo)本行ALP 活性、前列腺素E2（prostaglandins E2，PGE2）含量檢測以及Western blot 檢測NF-κB p65、BMP-7 和DNA 結(jié)合抑制因子2（inhibitor of DNA binding 2，Id2），并取C、D 組14、28 d 標(biāo)本行HE 染色觀察。 結(jié)果 各組大鼠均存活至實(shí)驗(yàn)完成。注射后3、7 d B組ALP 活性及PGE2 含量與A 組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；C 組較A 組增高，D 組較A 組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。注射后3、7 d，各組骨折端組織中均見NF-κB p65、BMP-7、Id2 表達(dá)，B 組各因子表達(dá)水平與A 組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）；C 組NF-κB p65 和BMP-7 蛋白表達(dá)水平較A 組增高，Id2 蛋白表達(dá)水平較A 組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）；D 組NF-κB p65、BMP-7 蛋白表達(dá)水平較A 組降低，Id2 蛋白表達(dá)較A 組增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）。組織學(xué)觀察示，注射后14、28 d C 組骨折端組織見大量骨性骨痂，而D 組28 d 時(shí)才見骨性骨痂。 結(jié) 論 NF- κB p65 可通過調(diào)控PGE2 分泌以及BMP-7 和Id2 蛋白表達(dá)促進(jìn)大鼠橈骨骨折的早期愈合。
目的 構(gòu)建hBMP-7 基因真核表達(dá)載體，觀察其在兔脂肪源性干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）的表達(dá)，并觀察其對ADSCs 向成骨細(xì)胞分化的影響。 方法 3 月齡清潔級健康日本大耳白兔，雌雄不限，體重3 ～ 4 kg。取兔皮下脂肪約5 mL，采用膠原酶消化離心貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng) ADSCs，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；CD44、CD49d、CD106 免疫熒光染色鑒定ADSCs。構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-hBMP-7，經(jīng)鑒定后利用LipofectamineTM 2000 介導(dǎo)轉(zhuǎn)染ADSCs，免疫組織化學(xué)染色檢測hBMP-7 在ADSCs 中的表達(dá)；ALP 定量測定、Ⅰ型膠原免疫熒光檢測hBMP-7 基因轉(zhuǎn)染對ADSCs 向成骨細(xì)胞分化的影響。 結(jié)果 倒置相差顯微鏡觀察示ADSCs 呈梭形、多角形分布；表面抗原標(biāo)志CD44、CD49d 呈陽性表達(dá)，CD106 呈陰性表達(dá)。成功構(gòu)建pcDNA3.1-hBMP-7 真核表達(dá)載體，并利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法成功導(dǎo)入ADSCs 中，免疫組織化學(xué)染色提示hBMP-7 能在ADSCs 中表達(dá)。ALP 定量測定示，轉(zhuǎn)染后7、10、14 d pcDNA3.1-hBMP-7 轉(zhuǎn)染組（實(shí)驗(yàn)組）ALP 活性明顯高于pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染組（對照組），差異有統(tǒng)計(jì)意義（P lt; 0.05）；轉(zhuǎn)染后7、14 d，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ型膠原表達(dá)量均高于對照組（P lt; 0.05）。 結(jié)論 構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-hBMP-7 可在兔ADSCs中表達(dá)，且轉(zhuǎn)染后的ADSCs ALP 定量測定、成骨標(biāo)志物Ⅰ型膠原的表達(dá)均高于pcDNA3.1 空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為開展以干細(xì)胞為載體的局部基因治療奠定了基礎(chǔ)。
目的 通過體外實(shí)驗(yàn)探討hVEGF165 和hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adenoassociated virus，rAAV）體外生物學(xué)活性，為體內(nèi)應(yīng)用其進(jìn)行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 分別采用rAAVhVEGF165-內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（實(shí)驗(yàn)組）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的rAAV-IRES-GFP（對照組）轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，于轉(zhuǎn)染后1、2、3、7 及14 d 應(yīng)用ELISA 法及轉(zhuǎn)染后14 d 應(yīng)用Western blot 法鑒定兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)；轉(zhuǎn)染后14 d 行細(xì)胞免疫熒光染色觀察hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)一致性。應(yīng)用第3 代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）管狀血管形成實(shí)驗(yàn)檢測hVEGF165 蛋白活性。取第3 代BMSCs 行誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)，Gomori 鈣鈷法ALP 染色及茜素紅法鈣鹽染色檢測hBMP-7 蛋白活性。 結(jié)果 ELISA 檢測示隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)逐漸升高；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)量均明顯高于對照組（P lt; 0.05）。Western blot 檢測示實(shí)驗(yàn)組可見hVEGF165 和hBMP-7表達(dá)，對照組未見陽性表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色觀察示實(shí)驗(yàn)組hVEGF165 和hBMP-7 染色呈陽性，表達(dá)部位和強(qiáng)度具有較好一致性；對照組未見陽性表達(dá)。HUVEC 管狀血管形成實(shí)驗(yàn)示實(shí)驗(yàn)組HUVEC 拉長變形、出芽且相互交聯(lián)成管狀樣結(jié)構(gòu)；與對照組相比，管狀血管數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。ALP 染色見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)深染顆粒，對照組細(xì)胞內(nèi)淺著色；與對照組相比，礦化結(jié)節(jié)數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 雙基因共表達(dá)rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7體外具有良好的生物學(xué)活性。
目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adeno-associated virus，rAAV）介導(dǎo)基因表達(dá)的時(shí)效性，為體內(nèi)應(yīng)用其進(jìn)行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定rAAV 轉(zhuǎn)染兔BMSCs 的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)。分別采用rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（實(shí)驗(yàn)組）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記平行對照rAAV-IRES-GFP（對照組）在最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)條件下轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs。于不同時(shí)間點(diǎn)分別行GFP 表達(dá)檢測、RT-PCR 檢測、Western blot 檢測明確rAAV 體外介導(dǎo)基因表達(dá)的時(shí)效性關(guān)系。將實(shí)驗(yàn)組及對照組病毒轉(zhuǎn)染后的BMSCs 以5 × 106 個(gè)/ mL 密度，分別注射至9 只2 月齡純種雄性新西蘭大耳白兔制備的肌袋模型內(nèi)各1 mL（實(shí)驗(yàn)組1 及對照組1），于不同時(shí)間點(diǎn)分別行GFP表達(dá)檢測、Western blot 檢測及ELISA 檢測明確rAAV 體內(nèi)介導(dǎo)基因表達(dá)的時(shí)效性關(guān)系。 結(jié) 果 rAAV 轉(zhuǎn)染兔BMSCs的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為5 × 104 v.g/cell。通過體外檢測顯示rAAV 轉(zhuǎn)染BMSCs 后1 d 即有目的基因表達(dá)，14 d 時(shí)表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，至28 d 時(shí)仍維持較強(qiáng)表達(dá)。通過體內(nèi)檢測顯示體內(nèi)轉(zhuǎn)染2 周可檢測到目的基因表達(dá)，6 周時(shí)表達(dá)強(qiáng) 度增強(qiáng)，8 周時(shí)仍維持較高水平。ELISA 法檢測實(shí)驗(yàn)組1 細(xì)胞培養(yǎng)上清中hVEGF165 和hBMP-7 含量分別為（248.67 ± 75.58）pg/mL 和（4.80 ± 0.61） ng/ mL， 對照組1 分別為（32.28 ± 8.42）pg/mL 和（0.64 ± 0.42）ng/mL，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 雙基因共表達(dá)rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 具有較好的轉(zhuǎn)染時(shí)效性。
目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）體內(nèi)誘導(dǎo)成骨及成血管的活性，為股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head，ANFH）的AAV 基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法 取體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，分別采用以下4 種病毒轉(zhuǎn)染并分為4 組：rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）-hBMP-7（A 組）、rAAV-hVEGF165- 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（B 組）、rAAV- hBMP-7-GFP（C 組）及rAAV-IRES-GFP（D 組）。取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作后肢缺血模型，并隨機(jī)分為4 組（n=6），于股骨肌肉內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應(yīng)用超聲影像學(xué)檢測兔后肢脛前動(dòng)脈血流量，行CD34 免疫組織化學(xué)染色檢測微血管生成。另取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作股骨肌袋模型，并隨機(jī)分為4 組（n=6），于肌袋內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應(yīng)用X 線片檢測兔后肢原位骨化，行von Kossa 鈣鹽染色檢測肌肉組織成骨礦化。 結(jié)果 病毒注射后動(dòng)物未出現(xiàn)局部或全身毒性反應(yīng)。病毒注射后8 周，A 組兔后肢脛前動(dòng)脈血流百分比及CD34 陽性微血管數(shù)均高于其他3 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；B 組高于C、D 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；C、D 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。病毒注射后8 周，A、C 組兔后肢肌袋內(nèi)出現(xiàn)可被X 線檢測到的原位骨化，von Kossa 肌肉組織鈣鹽染色可見大量鈣鹽沉積，且A 組原位骨化及鈣鹽沉積程度均較C 組強(qiáng)；B 組及D 組均未見明顯原位骨化及鈣鹽沉積形成。 結(jié)論 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 載體具有體內(nèi)誘導(dǎo)成骨及成血管的生物學(xué)活性。
目的研究多孔鉭與BMP-7復(fù)合后對兔關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損修復(fù)的作用，探討其軟骨修復(fù)能力及與宿主組織的生物相容性。 方法取成年新西蘭大耳白兔48只，隨機(jī)分為3組（n=16），制備兔股骨內(nèi)髁軟骨缺損模型，分別于右側(cè)股骨內(nèi)髁植入復(fù)合BMP-7多孔鉭材料（A組）、多孔鉭材料（B組）及不植入材料（C組）。術(shù)后觀察動(dòng)物一般狀況，術(shù)后4、8、16周取材行大體、組織學(xué)、掃描電鏡觀察，術(shù)后16周行Micro-CT觀察A、B組組織空隙內(nèi)軟骨及骨長入情況和多孔鉭周圍成骨情況。 結(jié)果術(shù)后動(dòng)物存活良好，手術(shù)切口均Ⅰ期愈合。大體觀察示，隨時(shí)間延長，A、B組術(shù)后缺損區(qū)材料表面均出現(xiàn)新生軟骨并逐漸覆蓋缺損區(qū)域，A組術(shù)后新生軟骨組織出現(xiàn)更早，表面平整光滑，修復(fù)程度較B組好；C組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)缺損區(qū)均未修復(fù)，表面逐漸被纖維組織填充。除術(shù)后4周A、B組軟骨缺損修復(fù)大體觀察評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，術(shù)后8、16周A組評分均高于B組（P < 0.05）。掃描電鏡觀察示，隨時(shí)間延長，A組材料表面新生軟骨及成骨細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞外基質(zhì)逐漸將材料覆蓋，孔隙內(nèi)長入的新生骨組織逐漸增多，A組新生骨組織及細(xì)胞外基質(zhì)分泌明顯多于B組。甲苯胺藍(lán)染色組織學(xué)觀察示，術(shù)后4、8、16周兩組多孔鉭界面新生軟骨及骨組織逐漸增加，出現(xiàn)新生骨小梁并向材料孔隙內(nèi)生長，骨組織與多孔鉭接觸趨于緊密，軟骨缺損區(qū)域逐漸被新生軟骨樣組織覆蓋，新生軟骨組織與多孔鉭結(jié)合越發(fā)緊密；A組新生軟骨及骨組織多于B組。Micro-CT觀測示，術(shù)后16周A組組織骨密度、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目、骨體積分?jǐn)?shù)均高于B組，骨小梁間隙低于B組，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論多孔鉭具有良好的生物相容性，其與BMP-7復(fù)合后可與宿主形成穩(wěn)定的連接與整合，對軟骨及軟骨下骨缺損修復(fù)起良好作用。
目的通過體外實(shí)驗(yàn)探討載負(fù) BMP-7 的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide），PLGA］緩釋微球?qū)ν?BMSCs 增殖和成軟骨分化的影響。方法采用復(fù)乳化-液中干燥法制備 BMP-7/PLGA 緩釋微球，并將 BMP-7/PLGA 緩釋微球與軟骨分化培養(yǎng)基混合后，在第 1、3、7、14、21 天收集其上清液作為體外釋放液。取 3～5 日齡新西蘭乳兔雙側(cè)股骨及脛骨分離培養(yǎng) BMSCs，取第 3 代 BMSCs 分為微球組和對照組，微球組在每 2～3 天換液過程中更換為 200 μL 不同時(shí)間點(diǎn)的 BMP-7/PLGA 緩釋微球體外釋放液，對照組使用等體積軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。采用 MTT 法測定兩組培養(yǎng) 1、3、7、14、21 d 的吸光度（A）值，檢測細(xì)胞增殖情況；培養(yǎng) 21 d 行番紅 O 染色、甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色觀察，并于 1、3、7、14、21 d 采用阿利新藍(lán)染色法測定糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）含量，檢測成軟骨細(xì)胞分化能力。結(jié)果MTT 檢測示，培養(yǎng) 1、3、7 d 兩組細(xì)胞均迅速增殖；7 d 后對照組增殖速度變緩，微球組仍呈持續(xù)快速增殖。培養(yǎng) 1、3、7 d 兩組 A 值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），14、21 d 微球組A 值顯著高于對照組（P<0.05）。培養(yǎng) 21 d 與對照組比較，微球組番紅 O 染色可見幾乎所有細(xì)胞核被染成鮮紅色，甲苯胺藍(lán)染色可見幾乎所有細(xì)胞核出現(xiàn)異染性紫紅色，Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色可見多數(shù)細(xì)胞核呈黃色或棕黃色，Ⅱ型膠原表達(dá)為強(qiáng)陽性。阿利新藍(lán)染色法測定示，培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞 GAG 含量呈持續(xù)增高趨勢，7 d 后對照組增高趨勢減緩，微球組仍呈持續(xù)高分泌狀態(tài)。培養(yǎng) 1、3、7 d 兩組 GAG 含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），14、21 d 微球組 GAG 含量顯著高于對照組（P<0.05）。結(jié)論復(fù)乳化-液中干燥法制備的 BMP-7/PLGA 緩釋微球在體外具有促進(jìn)兔 BMSCs 增殖和向軟骨細(xì)胞分化的能力。