目的探討腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因-1（MTA1）和血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）在食管鱗癌（ESCC）中表達及其與淋巴管生成的關(guān)系。 方法收集2013年3月至2014年1月遂寧市中心醫(yī)院胸心外科107例ESCC手術(shù)切除病例及56例正常食管組織的石蠟包埋組織樣本，采用免疫組織化學(xué)方法分別檢測MTA1、VEGF-C在ESCC中的表達；應(yīng)用D2-40標(biāo)記腫瘤組織中的微淋巴管內(nèi)皮細胞，并計數(shù)微淋巴管密度（LVD）；同時對其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系進行統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果ESCC中MTA1蛋白高表達率為50.4%，VEGF-C蛋白高表達率為58.8%，均明顯高于正常食管組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。T3/T4期ESCC組中MTA1 蛋白、VEGF-C 蛋白的高表達率亦明顯高于T1/T2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；MTA1 蛋白、VEGF-C 蛋白的高表達率在ESCC不同TNM分期中，經(jīng)Kruskal-Wallis Test 檢驗，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05））；ESCC中MTA1 蛋白、VEGF-C蛋白表達強度存在正相關(guān)性（Spearman系數(shù)r=0.512，P=0.000），且MTA1 蛋白、VEGF-C蛋白高表達組中LVD與MTA1蛋白、VEGF-C蛋白低表達組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MTA1 蛋白、VEGF-C蛋白的高表達率與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論ESCC中MTA1 和VEGF-C的表達存在正相關(guān)性，其可能共同促進ESCC淋巴管生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，兩者可能作為判斷ESCC預(yù)后的實驗室指標(biāo)。
目的 探討重組質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165 體外轉(zhuǎn)染對hBMSCs 成骨誘導(dǎo)分化的影響。 方 法 構(gòu)建hBMP-2 和hVEGF165 真核共表達載體。取健康成人自愿捐獻的骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，采用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165 和空質(zhì)粒載體（pIRES-neo）轉(zhuǎn)染至hBMSCs，作為A、B、C、D 組；另取相同數(shù)量的未轉(zhuǎn)染細胞作為對照組（E 組）。培養(yǎng)4 周，采用RT-PCR 檢測hBMP-2、hVEGF165 以及骨鈣mRNA 表達，Western blot 檢測細胞 hBMP-2 和 hVEGF165 表達，定量檢測ALP 活性，免疫組織化學(xué)方法檢測Col Ⅰ表達。 結(jié) 果 與E 組比較，A 組hBMSCs 高表達hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨鈣素，B 組大量表達骨鈣素及Col Ⅰ，C組高表達hVEGF165，而B 組hVEGF165 及C 組hBMP-2 和Col Ⅰ的表達與D、E 組相似，呈陰性或僅有痕量表達。A、B、C、D 及E 組ALP 活性分別為0.91 ± 0.03、0.90 ± 0.02、0.64 ± 0.03、0.67 ± 0.01、0.66 ± 0.02，A、B 組與E 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05），C、D、E 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 重組質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體能成功轉(zhuǎn)染hBMSCs，外源性hBMP-2 和 hVEGF165 基因在轉(zhuǎn)染細胞中能持續(xù)表達，并能增強hBMSCs 的成骨能力。
【摘 要】 目的 通過引入內(nèi)部核糖體進入位點序列（internal ribosome entry site，IRES），構(gòu)建帶有hVEGF165 及hBMP-7 雙基因的重組腺相關(guān)病毒載體（adeno-associated virus，AAV），并對其進行鑒定。 方法 以AAV 腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)（helper-free system）為基礎(chǔ)，將真核表達質(zhì)粒pIRES 中的IRES 片段定向克隆至腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAVMCS中，形成含有IRES 序列及上、下游多克隆位點的重組骨架質(zhì)粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B。PCR 擴增hVEGF165 和hBMP-7 基因，先后亞克隆入重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒IRES 序列上、下游的多克隆位點，獲得重組質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7。將其和包裝質(zhì)粒pAAV-RC、輔助質(zhì)粒pHelper 三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293 細胞，包裝重組腺相關(guān)病毒rAAVhVEGF165-IRES-hBMP-7，同時包裝含有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的重組病毒rAAV-IRES-GFP作平行對照。熒光顯微鏡下監(jiān)測病毒包裝效率，收獲重組病毒后感染AAV-HT1080 細胞測定病毒滴度，并通過病毒基因組外源基因擴增鑒定重組病毒的包裝是否成功。 結(jié)果 重組腺相關(guān)病毒骨架質(zhì)粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 經(jīng)雙酶切鑒定正確。熒光顯微鏡下觀察三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAV-293 細胞72 h 后，病毒包裝效率達95% ～ 100%，收獲的重組病毒具有較高濃度及活性，感染AAV-HT1080 效率達90%，熒光計數(shù)法測定病毒感染滴度達5.5 × 1011 vp/mL。提取重組病毒基因組成功擴增出外源目的基因hVEGF165 及hBMP-7 片段，重組病毒包裝成功。 結(jié)論 成功構(gòu)建帶有hVEGF165 及hBMP-7 雙基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7，收獲的病毒具有較高滴度，為今后利用腺相關(guān)病毒載體進行hVEGF165 及hBMP-7 雙基因共表達影響骨修復(fù)的體外及體內(nèi)研究提供實驗基礎(chǔ)。
【摘 要】 目的 建立兔Perthes 病模型并探討Perthes 病程中股骨頭局部VEGF 表達的變化及意義。 方 法 3 月齡新西蘭大白兔24 只，體重1.6 ～ 1.8 kg。取16 只兔作為實驗組，手術(shù)切斷左側(cè)圓韌帶和股骨頭支持帶血供，建立兔Perthes 病模型；剩余8 只作為對照組，按照上述程序左側(cè)股骨頭進行手術(shù)，但不打開關(guān)節(jié)囊，保持股骨頭正常血供。于術(shù)后1、2、4、8 周分別處死動物，取出股骨頭，行大體觀察、X 線片、組織學(xué)、VEGF 免疫組織化學(xué)染色和VEGF mRNA 原位雜交觀察。 結(jié)果 實驗組動物模型均制備成功，術(shù)后5 d 感染1 例，退出實驗。大體觀察：對照組各時間點股骨頭未見壞死改變；實驗組股骨頭隨時間延長逐漸粗糙、失去光澤，變小，可見塌陷。X 線片觀察：術(shù)后1、2 周，兩組股骨頭無明顯差異；4、8 周，實驗組股骨頭較對照組密度增高。對照組各時間點HE 染色均未見股骨頭壞死及修復(fù)改變；實驗組術(shù)后4、8 周可見血管及肉芽組織侵入，新骨形成，參與修復(fù)。免疫組織化學(xué)：對照組股骨頭骺軟骨中，肥大區(qū)表現(xiàn)出較高的VEGF免疫反應(yīng)性（VEGF immunoreactivity，VEGF-IR），而增殖區(qū)VEGF-IR 卻表現(xiàn)較低水平。術(shù)后1 周，實驗組股骨頭增殖區(qū)VEGF 陽性細胞率開始高于對照組，實驗組股骨頭肥大區(qū)VEGF 陽性細胞率明顯減少。術(shù)后8 周，實驗組股骨頭整個骺軟骨區(qū)均表現(xiàn)VEGF-IR，增殖區(qū)VEGF 陽性細胞率較對照組明顯增加；壞死股骨頭軟骨內(nèi)骨化中心修復(fù)重建，肥大區(qū)VEGF陽性細胞率較正常接近。術(shù)后1、2、4、8 周，實驗組骺軟骨增殖區(qū)VEGF 陽性細胞率與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt;0.01） ；術(shù)后1、2、4 周，實驗組骺軟骨肥大區(qū)VEGF 陽性細胞率與對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）。原位雜交觀察結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色觀察相似。缺血性壞死后，實驗組肥大區(qū)VEGF mRNA 表達喪失，增殖區(qū)VEGF mRNA 表達升高。軟骨內(nèi)骨化中心修復(fù)重建后，實驗組可見新形成的肥大區(qū)重新表達VEGF mRNA。 結(jié)論 VEGF 在壞死股骨頭骺軟骨促進血管發(fā)生、軟骨內(nèi)骨化中心的修復(fù)重建方面起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。
目的 研究BMSCs 移植對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后VEGF 受體胎肝激酶1（fetal liver kinase 1，F(xiàn)lk-1）基因和蛋白表達的影響，探討B(tài)MSCs 移植修復(fù)大鼠SCI 的機制。 方法 取4 周齡雄性Wistar 大鼠5 只，體重100 ～ 120 g，進行BMSCs 分離及培養(yǎng)。取81 只Wistar 雌性大鼠，體重220 ～ 250 g，采用改良Allen’s 打擊裝置制備SCI 模型，隨機分為3 組：假手術(shù)組（A 組，n=21），僅咬除T8 ～ 10 棘突和椎板；DMEM 組（B 組，n=30），SCI 區(qū)周圍注射DMEM；BMSCs 組（C 組，n=30），SCI 區(qū)周圍注射BMSCs。于移植術(shù)后1、3、5 d，采用RT-PCR 方法檢測各組大鼠SCI 區(qū)Flk-1 基因表達的變化；于移植術(shù)后3、7、14 d，免疫組織化學(xué)方法觀察脊髓內(nèi)Flk-1 蛋白的表達。 結(jié)果 原代培養(yǎng)的BMSCs 細胞形態(tài)多樣，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞形態(tài)逐漸趨于均一，多為扁平形和長梭形。RT-PCR 結(jié)果顯示，在移植術(shù)后1、3、5 d，C 組Flk-1 mRNA 表達水平與B 組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；但B、C 組與A 組比較，F(xiàn)lk-1 mRNA表達于術(shù)后1 d 明顯增加并達峰值（P lt; 0.01），術(shù)后3 d 下降（P lt; 0.01），至術(shù)后5 d 表達仍高于A組（P lt; 0.05）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，移植術(shù)后3 、7 d，B 組Flk-1 蛋白表達較A 組顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.01）；術(shù)后14 d，A、B 組Flk-1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05） ；移植術(shù)后3 d，B、C 組Flk-1 表達相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05），移植術(shù)后7 、14 d，C 組Flk-1 表達明顯高于B 組（P lt; 0.01）。 結(jié)論 SCI 后BMSCs 移植對Flk-1 mRNA 的表達無調(diào)節(jié)作用，但上調(diào)Flk-1 蛋白的表達，是修復(fù)SCI 的機制之一。
目的 研究CoCl2 對體外培養(yǎng)的鼠下頜骨成骨細胞的作用，觀察缺氧條件對成骨細胞VEGF 及TGF-β1 表達的影響，為臨床牽張成骨技術(shù)的分子生物學(xué)機制研究提供理論依據(jù)。 方法 取新生24 h 內(nèi)Wistar 大鼠下頜骨，改良酶消化法培養(yǎng)和純化成骨細胞，采用HE 染色、ALP 組織化學(xué)染色、Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)、鈣結(jié)節(jié)染色行細胞形態(tài)學(xué)及組織學(xué)鑒定，并繪制生長曲線。取第3 代最佳生長狀態(tài)的鼠下頜骨成骨細胞，用150 μmol/L CoCl2 處理（實驗組），設(shè)正常狀態(tài)下培養(yǎng)為對照組，分別于培養(yǎng)后0、3、6、9、12、24 h，采用免疫熒光技術(shù)檢測VEGF 及TGF-β1 表達。 結(jié) 果 HE染色示成骨細胞形態(tài)多樣，呈三角形、多角形、圓形及鱗片形等不規(guī)則形態(tài)，突起長短不一向外伸展，胞核清晰可見；胞漿豐富，呈粉紅色，胞核藍紫色，有時可見2 個細胞核，密集處細胞形態(tài)不明顯，分界模糊，僅見大圓核細胞。ALP 組織化學(xué)染色示細胞胞質(zhì)呈黑色顆粒，細胞核輪廓不清，細胞密集區(qū)可見大量陽性細胞。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色示實驗組陽性細胞均勻可見，胞漿呈棕黃色，胞核周圍尤為明顯，空白對照組細胞未見棕黃色顆粒。鈣結(jié)節(jié)染色示成骨細胞于蓋玻片上培養(yǎng)15 d 后，細胞聚集成不透明區(qū)域，呈結(jié)節(jié)樣；茜素紅染色后，有橙紅色著色。培養(yǎng)各時間點對照組細胞激光共聚焦顯微鏡下可見較弱的VEGF 表達熒光；實驗組細胞隨缺氧時間延長，VEGF 表達熒光強度值增加，于術(shù)后9 h 達高峰，隨后降至正常水平。培養(yǎng)各時間點激光共聚焦顯微鏡下可見兩組細胞均有TGF-β1 表達熒光，對照組各時間點熒光強度值均略高于VEGF 對照組；實驗組TGF-β1 表達在缺氧3 h 短期成倍增加，隨缺氧時間延長表達逐漸降低。 結(jié)論 經(jīng)新生大鼠下頜骨培養(yǎng)的成骨細胞性狀穩(wěn)定；適當(dāng)缺氧可誘導(dǎo)成骨細胞VEGF 和TGF-β1表達增強。
目的評估玻璃體腔內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子（anti-vascular endothelial growth factors，anti-VEGF）對視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion，RVO）繼發(fā)黃斑水腫（macular edema，ME）的療效。方法計算機檢索PubMed、EMbase、Web of Science、The Cochrane Library、CNKI、WanFang Data和VIP數(shù)據(jù)庫，搜集關(guān)于玻璃體腔內(nèi)注射貝伐單抗、雷珠單抗和阿柏西普治療RVO-ME的隨機對照試驗（RCT），檢索時限均從建庫至2021年9月17日。由2位研究者獨立篩選文獻、提取資料并評價納入研究的偏倚風(fēng)險后，采用RevMan 5.3軟件進行Meta分析。結(jié)果共納入11個RCT，包括2 436只眼，其中，視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞1 682只眼，視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞754只眼。Meta分析結(jié)果顯示：① 隨訪第6個月時，抗VEGF藥物治療RVO-ME在最佳矯正視力改善［MD=14.97，95%CI（10.09，19.86），P<0.000 01］和視網(wǎng)膜中央厚度的減少［MD=?218.21，95%CI（?295.56，?140.86），P<0.000 01］方面均優(yōu)于安慰劑組；在第12個月時，抗VEGF藥物治療RVO-ME在最佳矯正視力的改善［MD=5.70，95%CI（3.90，7.50），P<0.000 01］方面優(yōu)于安慰劑組；② 不同抗VEGF藥物在改善最佳矯正視力上，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。但不同抗VEGF藥物在視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞患者的視網(wǎng)膜中央厚度改善上：阿柏西普和貝伐單抗［MD=?46.79，95%CI（?83.12，?10.46），P=0.01］，貝伐單抗和雷珠單抗［MD=76.03，95%CI（30.76，121.30），P=0.001］，兩組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論現(xiàn)有證據(jù)表明，抗VEGF藥物在RVO-ME的治療中可提高視力，減少黃斑水腫。貝伐單抗可能是雷珠單抗或阿柏西普的有效替代品，現(xiàn)有證據(jù)尚無法確定它們在長期治療RVO期間最佳矯正視力改善和視網(wǎng)膜中央厚度減少是否存在差異，有待進一步研究驗證。
目的 探討VEGF受體3（VEGF receptor 3，VEGFR-3）在乳腺癌組織中的表達，分析其表達與乳腺癌臨床病理因素的關(guān)系，為乳腺癌的臨床治療及預(yù)后判斷提供依據(jù)。 方法 取2004年3月－2007月6月接受乳腺癌切除術(shù)的173例女性患者乳腺癌組織存檔石蠟標(biāo)本（實驗組），應(yīng)用組織芯片技術(shù)構(gòu)建乳腺癌組織芯片，HE染色判斷組織芯片質(zhì)量，免疫組織化學(xué)染色觀察VEGFR-3表達情況；并以同期接受乳腺良性病變切除術(shù)的19例女性患者乳腺組織存檔石蠟標(biāo)本作為對照（對照組）。將實驗組患者按照年齡、腫瘤直徑、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、病理分期以及雌激素受體、孕激素受體和人EGF受體2（human EGF receptor 2，HER-2）基因表達情況分組，比較VEGFR-3陽性表達率。 結(jié)果HE染色示兩組組織芯片質(zhì)量較好，能代表相應(yīng)疾病組織病理學(xué)形態(tài)。免疫組織化學(xué)染色觀察示，實驗組中96例（55.5%）可見VEGFR-3表達陽性，對照組均未見陽性染色。不同年齡及雌激素受體、孕激素受體表達與否，VEGFR-3陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05），腫瘤越大、病理分期越高，VEGFR-3陽性表達率顯著提高（P lt; 0.05）；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及HER-2基因表達陽性者VEGFR-3陽性表達率明顯高于各自陰性表達者（P lt; 0.05）。 結(jié)論VEGFR-3在乳腺癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，有望成為新的判斷預(yù)后指標(biāo)及治療靶點。
目的 探討采用VEGF-C基因修飾的淋巴結(jié)移植對移植淋巴結(jié)周圍組織內(nèi)淋巴內(nèi)皮細胞再生的影響。 方法取成年雄性SD大鼠36只，體重200.1～271.5 g，選取一側(cè)采用帶血管蒂淋巴結(jié)同側(cè)原位移植方法制備腋窩淋巴結(jié)移植模型后，隨機分為兩組（n=18），分別將1.5 × 108 PFU 帶Flag標(biāo)簽的VEGF-C基因過表達腺病毒載體及空載腺病毒載體注射入實驗組及對照組大鼠移植淋巴結(jié)中。術(shù)后3 d，免疫熒光染色觀察淋巴結(jié)內(nèi)帶Flag標(biāo)簽蛋白的表達情況；術(shù)后1、2、4周，免疫熒光染色觀察移植淋巴結(jié)周圍組織內(nèi)Prox-1蛋白的表達并計算其熒光密度值；術(shù)后2、4周，通過測定患肢皮下注射偶氮藍后大鼠血液在620 nm波長下吸光度（A）值，觀察淋巴回流功能改善情況，以正常大鼠（正常組）及淋巴結(jié)移植大鼠（空白對照組）作為對照。 結(jié)果術(shù)后3 d實驗組及對照組移植淋巴結(jié)內(nèi)均可檢測到帶Flag標(biāo)簽蛋白的表達。術(shù)后1、2、4周，實驗組移植淋巴結(jié)周圍組織內(nèi)Prox-1蛋白熒光密度值呈進行性增加，且均明顯強于對照組（P lt; 0.05）。正常組及空白對照組大鼠血液A值分別為0.539 ± 0.020及0.151 ± 0.007。術(shù)后2周實驗組及對照組A值分別為0.170 ± 0.011及0.168 ± 0.010，4周時分別為0.212 ± 0.016及0.197 ± 0.006，均顯著低于正常組（P lt; 0.05），但與空白組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；實驗組及對照組間比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論VEGF-C基因修飾的淋巴結(jié)移植能顯著促進移植淋巴結(jié)周圍組織內(nèi)淋巴內(nèi)皮細胞的再生，但在4周內(nèi)不能改善大鼠患肢淋巴回流功能。
目的通過基因水平和蛋白水平研究不同誘導(dǎo)濃度以及不同誘導(dǎo)時間重組人BMP-2（recombinant human BMP-2，rhBMP-2）調(diào)節(jié)人脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）表達VEGF的生物學(xué)特點。 方法從成人脂肪組織中分離培養(yǎng)ADSCs。取第3代細胞，分別用終濃度為0、50、100、200 ng/mL rhBMP-2誘導(dǎo)，24 h后收集樣本；另采用濃度為100 ng/mL rhBMP-2誘導(dǎo)（rhBMP-2誘導(dǎo)組），3、6、12、18、24、36、48 h后收集樣本，并設(shè)未誘導(dǎo)的相應(yīng)時間點細胞作為對照組；采用RT-PCR和ELISA檢測VEGF mRNA和蛋白表達。 結(jié)果RT-PCR及ELISA檢測示，不同濃度rhBMP-2誘導(dǎo)下VEGF mRNA相對表達量和蛋白表達均呈濃度依賴性，其中100 ng/mL組表達最高。50、100、200 ng/mL組VEGF mRNA相對表達量均高于0 ng/mL組（P lt; 0.05）；100 ng/mL組VEGF mRNA相對表達量最高，與其余兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。100 ng/mL組VEGF蛋白表達量顯著高于其余各組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P lt; 0.05）。100 ng/mL rhBMP-2誘導(dǎo)ADSCs后VEGF mRNA及蛋白表達呈時間依賴性。rhBMP-2誘導(dǎo)組誘導(dǎo)3、6 h時VEGF mRNA相對表達量及蛋白表達均低于對照組（P lt; 0.05）；12 h時VEGF表達較低，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）；18、24 h達高峰，rhBMP-2誘導(dǎo)組顯著高于對照組（P lt; 0.05）；36、48 h 兩組VEGF表達均明顯減少，比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論rhBMP-2調(diào)節(jié)人ADSCs表達VEGF具有濃度依賴性和時間依賴性。rhBMP-2最適誘導(dǎo)濃度為100 ng/mL，誘導(dǎo)至18～24 h是利用rhBMP-2促進組織工程骨血管化的關(guān)鍵時間段。