目的 探討重組質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165 體外轉(zhuǎn)染對(duì)hBMSCs 成骨誘導(dǎo)分化的影響。 方 法 構(gòu)建hBMP-2 和hVEGF165 真核共表達(dá)載體。取健康成人自愿捐獻(xiàn)的骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，采用陽離子脂質(zhì)體將構(gòu)建的質(zhì)粒pIRES-hBMP-2-hVEGF165、pIRES-hBMP-2、pIRES-hVEGF165 和空質(zhì)粒載體（pIRES-neo）轉(zhuǎn)染至hBMSCs，作為A、B、C、D 組；另取相同數(shù)量的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照組（E 組）。培養(yǎng)4 周，采用RT-PCR 檢測(cè)hBMP-2、hVEGF165 以及骨鈣mRNA 表達(dá)，Western blot 檢測(cè)細(xì)胞 hBMP-2 和 hVEGF165 表達(dá)，定量檢測(cè)ALP 活性，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Col Ⅰ表達(dá)。 結(jié) 果 與E 組比較，A 組hBMSCs 高表達(dá)hBMP-2、hVEGF165、Col Ⅰ及骨鈣素，B 組大量表達(dá)骨鈣素及Col Ⅰ，C組高表達(dá)hVEGF165，而B 組hVEGF165 及C 組hBMP-2 和Col Ⅰ的表達(dá)與D、E 組相似，呈陰性或僅有痕量表達(dá)。A、B、C、D 及E 組ALP 活性分別為0.91 ± 0.03、0.90 ± 0.02、0.64 ± 0.03、0.67 ± 0.01、0.66 ± 0.02，A、B 組與E 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），C、D、E 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 重組質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體能成功轉(zhuǎn)染hBMSCs，外源性hBMP-2 和 hVEGF165 基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中能持續(xù)表達(dá)，并能增強(qiáng)hBMSCs 的成骨能力。
目的 構(gòu)建攜帶hVEGF165 基因的重組腺病毒載體pAdxsi- 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）-hVEGF165 ，體外轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，觀察轉(zhuǎn)染后hVEGF165 的表達(dá)情況以及對(duì)BMSCs 生長增殖的影響，為進(jìn)行血管再生的基因治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 將hVEGF165 從原始質(zhì)粒切下連接到pShuttle- 巨細(xì)胞病毒-EGFP 重組穿梭載體，并轉(zhuǎn)移至pAdxsi 載體上，獲得重組腺病毒載體質(zhì)粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165 ，進(jìn)行酶切鑒定及基因測(cè)序。采用PacI 限制性內(nèi)切酶線性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165 ，并轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293，收獲重組腺病毒，測(cè)定病毒滴度。貼壁法培養(yǎng)Wistar 大鼠BMSCs，體外轉(zhuǎn)染攜帶EGFP 基因的重組腺病毒（pAdxsi-EGFP），熒光倒置相差顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)確定最佳病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicities of infection，MOI）。依據(jù)最佳MOI 轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFP-hVEGF165 至BMSCs，采用Western blot、RT-PCR 及ELISA 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后hVEGF165 的表達(dá)；MTT 法評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染后BMSCs 生長增殖情況。 結(jié)果 酶切鑒定及基因測(cè)序提示重組腺病毒載體質(zhì)粒含有hVEGF165 cDNA；經(jīng)多輪感染、擴(kuò)增后，病毒滴度可達(dá)1 × 1010 pfu/mL。熒光倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFP 后MOI 為150 pfu/cell 時(shí)轉(zhuǎn)染效果最佳，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率約88%。Western blot 和RT-PCR 檢測(cè)示，pAdxsi-EGFP-hVEGF165 轉(zhuǎn)染BMSCs 48 h 后在蛋白質(zhì)和基因水平均可有效表達(dá)hVEGF165 ；ELISA 檢測(cè)示其含量在7 d 達(dá)高峰，在20 d 時(shí)仍有表達(dá)，1、3、5、7、9、11、13、15、20 d 各時(shí)間點(diǎn)hVEGF165 含量均顯著高于EGFP 基因轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組（P lt; 0.05）。MTT 結(jié)果顯示，各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染pAdxsi-EGFPhVEGF165的BMSCs 與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的吸光度（A）值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。 結(jié)論 BMSCs 是一種較理想的基因載體細(xì)胞，成功制備的重組腺病毒載體質(zhì)?？稍贛OI 值為150 時(shí)將hVEGF165 基因有效轉(zhuǎn)染至BMSCs；轉(zhuǎn)染后hVEGF165 表達(dá)水平較高、持續(xù)時(shí)間較長，且對(duì)BMSCs 的生長增殖無明顯影響。
目的 探索轉(zhuǎn)染hVEGF165 基因、人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α（human stromal cell-derived factor 1α，hSDF- 1α）基因的大鼠成肌細(xì)胞在體外mRNA 和蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步檢測(cè)這兩種基因?qū)ρ苌傻膮f(xié)同效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。 方法 取新生1 日齡雄性SD 大鼠，采用胰蛋白酶消化法體外分離培養(yǎng)、純化成肌細(xì)胞，并采用結(jié)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。將質(zhì)粒增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）-hVEGF165 和EGFP-hSDF-1α 轉(zhuǎn)染第3 代成肌細(xì)胞（轉(zhuǎn)染組），以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照組。體外培養(yǎng)后各時(shí)間點(diǎn)行RT-PCR、Western blot、ELISA 法檢測(cè)兩種質(zhì)粒mRNA 及蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)鑒定確定為成肌細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察示成功轉(zhuǎn)染hSDF- 1α和hVEGF165 進(jìn)入成肌細(xì)胞，可見綠色熒光表達(dá)。RT-PCR 檢測(cè)示轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后2、4、6、8 d 均可見hVEGF165 和hSDF- 1αmRNA 的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)示轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后2、4、6、8 d 成肌細(xì)胞內(nèi)均有hVEGF165 和hSDF-1α 蛋白表達(dá)，對(duì)照組均無相關(guān)表達(dá)。ELISA 檢測(cè)示對(duì)照組hSDF-1α 和hVEGF165 均穩(wěn)定表達(dá)，呈較低水平。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染2 d 時(shí)hSDF-1α 和hVEGF165 表達(dá)均達(dá)較高水平，之后呈逐漸下降趨勢(shì)；轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)間hSDF-1α 和hVEGF165 表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 轉(zhuǎn)染hSDF-1α 和hVEGF165 進(jìn)入大鼠成肌細(xì)胞后在體外均有表達(dá)，為下一步研究體內(nèi)是否表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
目的 通過體外實(shí)驗(yàn)探討hVEGF165 和hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adenoassociated virus，rAAV）體外生物學(xué)活性，為體內(nèi)應(yīng)用其進(jìn)行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 分別采用rAAVhVEGF165-內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（實(shí)驗(yàn)組）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記的rAAV-IRES-GFP（對(duì)照組）轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，于轉(zhuǎn)染后1、2、3、7 及14 d 應(yīng)用ELISA 法及轉(zhuǎn)染后14 d 應(yīng)用Western blot 法鑒定兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)；轉(zhuǎn)染后14 d 行細(xì)胞免疫熒光染色觀察hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)一致性。應(yīng)用第3 代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）管狀血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)hVEGF165 蛋白活性。取第3 代BMSCs 行誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn)，Gomori 鈣鈷法ALP 染色及茜素紅法鈣鹽染色檢測(cè)hBMP-7 蛋白活性。 結(jié)果 ELISA 檢測(cè)示隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，兩組hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)逐漸升高；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)hVEGF165 和hBMP-7 表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P lt; 0.05）。Western blot 檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組可見hVEGF165 和hBMP-7表達(dá)，對(duì)照組未見陽性表達(dá)。細(xì)胞免疫熒光染色觀察示實(shí)驗(yàn)組hVEGF165 和hBMP-7 染色呈陽性，表達(dá)部位和強(qiáng)度具有較好一致性；對(duì)照組未見陽性表達(dá)。HUVEC 管狀血管形成實(shí)驗(yàn)示實(shí)驗(yàn)組HUVEC 拉長變形、出芽且相互交聯(lián)成管狀樣結(jié)構(gòu)；與對(duì)照組相比，管狀血管數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。ALP 染色見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)深染顆粒，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)淺著色；與對(duì)照組相比，礦化結(jié)節(jié)數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 雙基因共表達(dá)rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7體外具有良好的生物學(xué)活性。
目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒載體（recombinant adeno-associated virus，rAAV）介導(dǎo)基因表達(dá)的時(shí)效性，為體內(nèi)應(yīng)用其進(jìn)行骨壞死的基因治療奠定理論基礎(chǔ)。 方法 應(yīng)用熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定rAAV 轉(zhuǎn)染兔BMSCs 的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)。分別采用rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）- hBMP-7（實(shí)驗(yàn)組）、綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記平行對(duì)照rAAV-IRES-GFP（對(duì)照組）在最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)條件下轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs。于不同時(shí)間點(diǎn)分別行GFP 表達(dá)檢測(cè)、RT-PCR 檢測(cè)、Western blot 檢測(cè)明確rAAV 體外介導(dǎo)基因表達(dá)的時(shí)效性關(guān)系。將實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組病毒轉(zhuǎn)染后的BMSCs 以5 × 106 個(gè)/ mL 密度，分別注射至9 只2 月齡純種雄性新西蘭大耳白兔制備的肌袋模型內(nèi)各1 mL（實(shí)驗(yàn)組1 及對(duì)照組1），于不同時(shí)間點(diǎn)分別行GFP表達(dá)檢測(cè)、Western blot 檢測(cè)及ELISA 檢測(cè)明確rAAV 體內(nèi)介導(dǎo)基因表達(dá)的時(shí)效性關(guān)系。 結(jié) 果 rAAV 轉(zhuǎn)染兔BMSCs的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為5 × 104 v.g/cell。通過體外檢測(cè)顯示rAAV 轉(zhuǎn)染BMSCs 后1 d 即有目的基因表達(dá)，14 d 時(shí)表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，至28 d 時(shí)仍維持較強(qiáng)表達(dá)。通過體內(nèi)檢測(cè)顯示體內(nèi)轉(zhuǎn)染2 周可檢測(cè)到目的基因表達(dá)，6 周時(shí)表達(dá)強(qiáng) 度增強(qiáng)，8 周時(shí)仍維持較高水平。ELISA 法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組1 細(xì)胞培養(yǎng)上清中hVEGF165 和hBMP-7 含量分別為（248.67 ± 75.58）pg/mL 和（4.80 ± 0.61） ng/ mL， 對(duì)照組1 分別為（32.28 ± 8.42）pg/mL 和（0.64 ± 0.42）ng/mL，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論 雙基因共表達(dá)rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 具有較好的轉(zhuǎn)染時(shí)效性。
目的 探討hVEGF165 及hBMP-7 共表達(dá)重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus，rAAV）體內(nèi)誘導(dǎo)成骨及成血管的活性，為股骨頭缺血性壞死（avascular necrosis of the femoral head，ANFH）的AAV 基因治療提供理論基礎(chǔ)。 方法 取體外培養(yǎng)的第3 代兔BMSCs，分別采用以下4 種病毒轉(zhuǎn)染并分為4 組：rAAV-hVEGF165- 內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列（internal ribosome entry site，IRES）-hBMP-7（A 組）、rAAV-hVEGF165- 綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（B 組）、rAAV- hBMP-7-GFP（C 組）及rAAV-IRES-GFP（D 組）。取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作后肢缺血模型，并隨機(jī)分為4 組（n=6），于股骨肌肉內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應(yīng)用超聲影像學(xué)檢測(cè)兔后肢脛前動(dòng)脈血流量，行CD34 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)微血管生成。另取24 只雄性新西蘭大耳白兔制作股骨肌袋模型，并隨機(jī)分為4 組（n=6），于肌袋內(nèi)植入上述4 組病毒轉(zhuǎn)染的BMSCs，8 周后應(yīng)用X 線片檢測(cè)兔后肢原位骨化，行von Kossa 鈣鹽染色檢測(cè)肌肉組織成骨礦化。 結(jié)果 病毒注射后動(dòng)物未出現(xiàn)局部或全身毒性反應(yīng)。病毒注射后8 周，A 組兔后肢脛前動(dòng)脈血流百分比及CD34 陽性微血管數(shù)均高于其他3 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；B 組高于C、D 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）；C、D 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。病毒注射后8 周，A、C 組兔后肢肌袋內(nèi)出現(xiàn)可被X 線檢測(cè)到的原位骨化，von Kossa 肌肉組織鈣鹽染色可見大量鈣鹽沉積，且A 組原位骨化及鈣鹽沉積程度均較C 組強(qiáng)；B 組及D 組均未見明顯原位骨化及鈣鹽沉積形成。 結(jié)論 rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7 載體具有體內(nèi)誘導(dǎo)成骨及成血管的生物學(xué)活性。