目的 了解近年來同種闊筋膜臨床應用的研究進展。 方法 查閱國內(nèi)外同種闊筋膜應用基礎、處理技術和臨床應用的相關文獻，進行總結(jié)分析。 結(jié)果 同種闊筋膜具有細胞成分少、膠原纖維平行致密的組織學特點和免疫原性低的特點，經(jīng)過不同方式處理和保存后，以細胞外基質(zhì)為主要成分的支架形式供臨床應用，并成功應用于眼科、泌尿外科、骨科和整形外科等領域，并已取得較為理想的治療效果。 結(jié)論 同種闊筋膜作為一種天然的生物材料在臨床修復缺損和功能重建中有著獨特優(yōu)勢，隨著生物醫(yī)學技術的發(fā)展，有望應用于更多領域。
目的 組織工程皮膚已逐漸應用于臨床，但其免疫原性仍存在爭議。通過重度聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠重建人免疫系統(tǒng)，觀察移植的組織工程皮膚的免疫排斥情況。 方法 按朱堂友等的方法體外構(gòu)建組織工程皮膚和無細胞真皮基質(zhì)。取雄性4 ～ 6 周齡SCID 小鼠20 只，體重16 ～ 17 g，隨機分為4 組（n=5）。A、B、C 組于小鼠側(cè)腹部切除1 cm × 1 cm 大小全層皮膚后，A 組移植組織工程皮膚，B 組移植自愿捐贈的人包皮，C 組將無細胞真皮基質(zhì)埋植皮下；D 組為正常對照，不作處理。移植術后2 周A、B、C 組取材行HE 染色，觀察各移植材料存活情況。并于各組小鼠腹腔注射3 × 107 個人脾淋巴細胞，4 周內(nèi)定期行大體、組織學、免疫組織化學、人IgG 免疫熒光染色，觀察是否發(fā)生免疫排斥反應。 結(jié)果 HE 染色示A 組組織工程皮膚具有真、表皮雙層結(jié)構(gòu)，類似人正常皮膚組織；B 組人包皮仍保持人皮膚的正常組織結(jié)構(gòu)；C 組無細胞真皮基質(zhì)位于原位，無明顯被降解跡象。植入人脾淋巴細胞后，A、C、D 組HE 染色未見明顯炎性細胞浸潤；同時間點B 組炎性細胞浸潤程度均明顯高于其他3 組，比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。A 組植入人脾淋巴細胞2 周后表皮全層細胞抗人角蛋白14 單克隆抗體（monoclonal anti-body，mAb）染色陽性，抗人Ⅳ型膠原mAb 染色陽性；A、C、D 組抗人CD3、CD4、CD8 mAb 染色均未見陽性細胞；B 組2 周后真皮、皮下組織中大量抗人CD3、CD4 和CD8 mAb 染色陽性細胞。A、C、D 組于植入人脾淋巴細胞后人IgG 免疫熒光染色均未見陽性結(jié)果；B 組3 周后真皮深部大血管管壁人IgG mAb 免疫熒光染色陽性。 結(jié)論 組織工程皮膚免疫原性較弱，植入SCID 小鼠后未見明顯的免疫排斥反應。
【摘 要】 目的 應用酶法制備豬主動脈脫細胞基質(zhì)，并評價其生物學性能。 方法 取新鮮屠宰的16 根肉豬降主動脈，長10 ～ 12 cm，應用0.1% 胰蛋白酶和0.01% EDTA 于37℃震蕩條件下脫除細胞成分，HE 和Masson 染色行脫細胞基質(zhì)的組織學觀察，掃描電鏡和透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。應用單軸拉伸方法比較脫細胞前和脫細胞后48、96 和120 h 時材料兩斷端厚度、極限抗張強度（ultimate tension stress，UTS）和斷裂伸長率（strain of failure，SOF），繪制應力-應變曲線。取成年雜種犬3 只，體重20 ～ 30 kg，雌雄不限。將脫細胞前后片狀主動脈基質(zhì)埋植于犬脊柱兩側(cè)皮下，分別于埋植后1、3 和6 周取材，行HE 染色觀察，參照半定量的Wakitani 評分法，對取材時的大體形態(tài)、浸潤細胞種類和數(shù)量、新生血管等指標進行比較，觀察宿主炎性細胞反應和脫細胞基質(zhì)變化。將犬內(nèi)皮細胞種植于豬脫細胞基質(zhì)，HE 染色和掃描電鏡觀察細胞相容性。 結(jié)果 HE 染色和電鏡檢查顯示在96 h 可將新鮮豬主動脈細胞成分脫除，Masson 染色顯示細胞外纖維成分保留完整。脫細胞前后的動脈基質(zhì)厚度、UTS 和SOF 差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05），但UTS 顯示降低趨勢，SOF 則呈現(xiàn)增加趨勢，應力- 應變曲線呈現(xiàn)力學強度降低和延展性增加的變化趨勢。犬皮下埋植，各組脫細胞標本炎性細胞浸潤明顯減輕，6 周時以成纖維細胞浸潤為主，且基質(zhì)中見新生毛細血管。半定量組織學評分，在大體觀察、浸潤細胞種類和數(shù)量方面與脫細胞前比較有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）；新生血管數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。HE 染色和掃描電鏡顯示種植的內(nèi)皮細胞可在基質(zhì)表面形成單細胞層。 結(jié)論 應用0.1% 胰蛋白酶和0.01% EDTA 持續(xù)振蕩96 h 制備的豬主動脈脫細胞基質(zhì)，在生物力學、免疫原性和細胞相容性方面可滿足血管組織工程的需要。
目的 觀察組織工程皮膚的種子細胞角質(zhì)形成細胞體外培養(yǎng)后的免疫原性變化情況。 方法 取自愿捐獻的健康兒童、青少年包皮，采用分離酶、胰蛋白酶兩步消化法進行體外培養(yǎng)并傳代至5代，行苔盼藍計數(shù)細胞活性。SP法標記各代角質(zhì)形成細胞中的朗格漢斯細胞和黑色素細胞，計算其占總細胞數(shù)的百分比。各代角質(zhì)形成細胞與從外周血中分離培養(yǎng)淋巴細胞進行混合培養(yǎng)，觀察淋巴細胞增殖情況，閃爍儀計數(shù)cpm值。 結(jié)果 培養(yǎng)的細胞生長良好，原代及傳代后的細胞融合后呈鋪路石樣生長。細胞凍存后復蘇，苔盼藍染色細胞活力gt;80%。原代中朗格漢斯細胞占5.8%，黑色素細胞占8.1%；1代中朗格漢斯細胞占2.1％，黑色素細胞占2.8％；2代后二者均消失。cpm值原代482.13±46.61，1代362.50±35.12，2代228.38±51.46，3代171.86±34.63，4代143.63±15.95，5代123.25±14.39，與對照組53.67±8.61比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。原代、1代與其他各代比較，2代與4、5代比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；2代與3代間，3、4代及5代間，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 結(jié)論 異體角質(zhì)形成細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后不斷傳代，細胞免疫原性逐漸下降。
目的 評價麻疹- 腮腺炎- 風疹- 水痘四聯(lián)疫苗的免疫效果和安全性。方法 采用Cochrane 系統(tǒng)評價的方法，電子檢索1990 年到2010 年4 月期間 PubMed、BIOSIS Previews、CDSR、Cochrane Library、CBM、CNKI、VIP 等，輔以手工檢索及追查已納入文獻的參考文獻。納入比較麻疹- 腮腺炎- 風疹- 水痘四聯(lián)疫苗（MMRV）與麻疹- 腮腺炎- 風疹三聯(lián)疫苗和水痘疫苗（MMR+V）分別接種的隨機對照試驗（RCT）。由兩名研究者獨立篩選文獻、評價質(zhì)量、提取數(shù)據(jù)并交叉核對。對符合納入標準的研究采用RevMan 4.2.10 進行Meta 分析。結(jié)果 共納入5 個RCT，其中B 級2 個，C 級3 個。Meta 分析結(jié)果顯示，MMRV 組和MMR+V 組的安全性指標比較：① 接種部位疼痛發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義［RR=0.94，95%CI（0.83，1.05），P=0.28］；② 接種部位紅腫發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義［RR=1.08，95%CI（0.90，1.29），P=0.40］；③ 接種部位硬結(jié)發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義［RR=1.16，95%CI（0.95，1.43），P=0.14］；④ 接種后發(fā)熱率差異有統(tǒng)計學意義［RR=1.20，95%CI（1.12，1.29），Plt;0.000 01］；⑤ 接種后全身皮疹發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義［RR=1.18，95%CI（1.00，1.41），P=0.05］；兩組免疫原性指標比較：① 接種后血清麻疹抗體陽轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計學意義［RR=1.00，95%CI（0.99，1.01），P=0.80］；② 血清腮腺炎抗體陽轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計學意義［RR=0.99，95%CI（0.50，1.01），P=0.11］；③ 血清風疹抗體陽轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計學意義［RR=1.00，95%CI（0.99，1.01），P=0.68］；④ 血清水痘抗體陽轉(zhuǎn)率差異無統(tǒng)計學意義［RR=1.00，95%CI（0.99，1.01），P=0.58］。 結(jié)論 與MMR+V分開接種相比，MMRV 四聯(lián)疫苗具有同等的免疫效果，在免疫安全性方面，除接種后發(fā)熱率稍高外，其他局部和全身反應性良好。鑒于MMRV 四聯(lián)疫苗在免疫效果和安全性方面的良好表現(xiàn)以及它在減少接種次數(shù)方面的作用，認為MMRV 四聯(lián)疫苗可以作為兒童預防接種的候選疫苗進行接種。后續(xù)工作中需加強對疫苗新組分引起發(fā)熱機制的研究。鑒于納入研究的整體質(zhì)量不高且數(shù)量有限，本系統(tǒng)評價中的部分證據(jù)引用需謹慎，建議在今后的研究中擴大樣本量、完善試驗設計、增加分析指標，以提高研究質(zhì)量和論證強度。
目的研究同種異體關節(jié)移植中骨膜和骨髓經(jīng)低溫凍存處理后的免疫原性，探索同種異體關節(jié)制備的合適方法。 方法6月齡新西蘭白兔5只，體重2.6～3.0 kg，切取雙側(cè)膝關節(jié)，分離骨膜及骨髓，梯度降溫凍存1個月，經(jīng)復溫后無菌研磨，混合生理鹽水制備骨膜、骨髓懸濁液。6月齡青紫藍兔18只，體重2.1～2.8 kg，隨機分成3組（n=6）：A、B、C組分別于腹腔注射生理鹽水、骨膜懸濁液、骨髓懸濁液。測定注射前及注射后1、2周血清IL-2、IL-6、TNF-α濃度和外周靜脈血CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比值。 結(jié)果IL-2測定：組內(nèi)比較注射前后濃度無時間變化趨勢（P=0.241）；組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.055）。IL-6測定：組內(nèi)比較注射后濃度出現(xiàn)顯著下降趨勢（P=0.040）；組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.357）。TNF-α測定：組內(nèi)比較注射前后濃度無時間變化趨勢（P=0.925）；組間比較B組濃度較其余兩組顯著升高（P＜0.05）。CD4+T細胞/CD8+T細胞比值測定：組內(nèi)比較注射前后無時間變化趨勢（P=0.248）；組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.646）。 結(jié)論經(jīng)低溫凍存處理后的骨膜、骨髓無顯著免疫原性；制備同種異體關節(jié)時建議保留骨膜，去除骨髓，徹底沖洗松質(zhì)骨中的紅骨髓，降低其免疫原性。
目的研究經(jīng)成骨誘導分化的人臍帶血間充質(zhì)干細胞（umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）表面免疫分子的表達以及體外調(diào)節(jié)T淋巴細胞增殖反應的功能。 方法取自愿捐贈的臍靜脈血分離獲取UCB-MSCs，體外擴增至第3代，行成骨誘導培養(yǎng)2周。流式細胞儀檢測成骨誘導分化前后UCB-MSCs免疫分子人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）Ⅰ類分子、HLA-Ⅱ類分子的表達。首先以成骨分化的UCB-MSCs刺激異體T淋巴細胞增殖，未誘導的UCB-MSCs設為對照。共設立UCB-MSCs 1×102、1×103、1×104和1×105個/孔4種不同細胞密度，分為IFN-γ預處理組和未處理組。然后以植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激T淋巴細胞增殖，分別加入上述不同數(shù)量級的未誘導與成骨誘導分化的UCB-MSCs，觀察對T淋巴細胞增殖的影響，并同時加入IL-2檢測對UCB-MSCs抑制T淋巴細胞增殖作用的逆轉(zhuǎn)。最后建立Transwell共培養(yǎng)體系，研究成骨誘導分化的UCB-MSCs對混合T淋巴細胞反應的抑制作用是否為接觸抑制性。 結(jié)果未誘導的UCB-MSCs高表達HLA-Ⅰ類分子，不表達HLA-Ⅱ類分子；經(jīng)成骨誘導分化的UCB-MSCs HLA-Ⅱ類分子的陽性表達率升高。未誘導的UCB-MSCs對異體T淋巴細胞增殖有顯著抑制效果，而成骨誘導分化的UCB-MSCs對T淋巴細胞增殖的抑制作用明顯減弱（且無細胞數(shù)量依賴性），并且在IFN-γ作用后，有刺激T淋巴細胞增殖的效果。密度為1×104個/孔及1×105個/孔時未誘導的UCB-MSCs可抑制PHA刺激的T淋巴細胞增殖，但加入IL-2后該抑制作用被逆轉(zhuǎn)；而成骨誘導分化的UCB-MSCs則不具有抑制T淋巴細胞增殖的作用。Transwell共培養(yǎng)結(jié)果表明，與直接接觸培養(yǎng)相似，未誘導的UCB-MSCs可顯著抑制T淋巴細胞增殖反應，而成骨誘導分化的UCB-MSCs抑制能力明顯減弱。 結(jié)論經(jīng)成骨誘導分化的UCB-MSCs抑制混合T淋巴細胞增殖反應的效果明顯低于未經(jīng)成骨誘導分化的UCB-MSCs，不適合作為骨組織工程或細胞治療的同種異體種子細胞來源。
目的應用組織工程學方法去除人同種心臟瓣膜（HV）的內(nèi)皮細胞成分或全部細胞成分，比較兩種去細胞HV的免疫原性變化。 方法采用低滲液-去污劑（1% Triton）-核酸酶[1μg/ml核糖核酸酶（RNase）和10μg/ml去氧核糖核酸酶（DNase）[去細胞法去除HV表面的內(nèi)皮細胞成分，保留間質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性；采用低滲液-去污劑（1%去氧膽酸）-核酸酶[20μg/ml RNase和200μg/ml DNase]去細胞法去除HV組織中所有細胞成分，保留完整的細胞外基質(zhì)。免疫組織化學方法測定HLA-DR抗原在HV組織中的表達；行大鼠皮下移植試驗，組織學評價及定性、定量分析組織的鈣化程度。 結(jié)果免疫組織化學結(jié)果證實HV去內(nèi)皮細胞和去全部細胞后組織中HLA-DR抗原表達均下降，但去全部細胞HV的HLA-DR抗原表達下降更為顯著。大鼠皮下移植實驗結(jié)果表明深低溫液氮保存HV和去內(nèi)皮細胞HV組織中有大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為著，管壁組織更為顯著；去全部細胞HV炎性反應較輕，僅組織邊緣有少量炎性細胞浸潤。鈣鹽染色深低溫液氮保存HV和去內(nèi)皮細胞HV組織中可見鈣鹽沉積，呈現(xiàn)大量黑色顆粒，管壁組織更為顯著；而去全部細胞HV組織中鈣鹽沉積極少。原子吸收光譜法定量分析結(jié)果表明去全部細胞HV組織中鈣離子含量明顯低于去內(nèi)皮細胞HV和深低溫液氮保存HV（P＜0.05），后兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 結(jié)論去全部細胞HV組織免疫原性顯著下降，移植后炎性反應和組織鈣化程度顯著減輕。去內(nèi)皮細胞HV組織免疫原性及移植后炎性反應有所下降，但移植后組織鈣化程度仍顯著增高，且管壁組織鈣鹽含量增高較瓣葉組織更加顯著，提示組織中大量的間質(zhì)細胞可能是參與HV移植后免疫反應、導致HV移植后鈣化毀損的主要組織成份。
目的探討經(jīng)高氯酸鈉（NaClO4）處理后的脫細胞氣管基質(zhì)材料的免疫原性及其生物相容性。方法取 2 月齡新西蘭兔脛骨骨髓，采用全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng) BMSCs。取 10 只 6 月齡成年新西蘭兔氣管，修剪至每段 1.5 cm，隨機分為對照組（A1 組，n=5），僅剝離氣管外表面疏松結(jié)締組織；實驗組（B1 組，n=5）采用改良 NaClO4 浸泡法脫細胞處理。MTT 法檢測兩組支架浸提液的細胞毒性；免疫組織化學染色觀察支架主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex，MHC）類抗原表達。取生長狀態(tài)良好的第 4 代 BMSCs 接種至兩組支架，制備細胞-支架復合物，培養(yǎng) 48 h 時行 Giemsa 染色，倒置顯微鏡觀察材料周圍的細胞活性；7、14 d 掃描電鏡觀察支架上的細胞狀態(tài)。取 10 只 6 月齡成年新西蘭兔，隨機分成對照組（A2 組，n=5）和實驗組（B2 組，n=5），分別于頸背部皮下皮囊埋植已制備的新鮮氣管和脫細胞氣管。術后行大體觀察，并于術后 5、10、15、20、25、30 d 分析血清免疫球蛋白 IgM 和 IgG 含量的動態(tài)變化，術后 30 d 行 HE 染色觀察。結(jié)果MTT 檢測示，B1 組浸提液的細胞增殖情況與 A1 組或純培養(yǎng)基陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；免疫組織化學染色觀察示，B1 組支架經(jīng)脫細胞處理后可顯著降低基質(zhì)材料的抗原性。細胞-支架復合物培養(yǎng) 48 h Giemsa 染色示，兩組材料周圍的細胞貼壁生長良好。培養(yǎng) 7、14 d 掃描電鏡觀察示，細胞在 A1 組氣管材料外壁上貼附良好，呈扁平的圓形、橢圓形，細胞排列緊密，成簇分布；細胞在 B1 組氣管材料外壁上呈單片狀生長，形態(tài)與 A1 組相似，生長趨勢較好。同種異體動物體內(nèi)實驗顯示，B2 組材料的排斥反應顯著低于 A2 組；術后各時間點 A2 組的 IgM 和 IgG 含量均顯著高于 B2 組（P<0.05）；HE 染色示，B2 組未見炎性細胞深層滲透或破壞氣管結(jié)構(gòu)，未見鈣化、排斥等不良反應。結(jié)論經(jīng) NaClO4 化學脫細胞處理后，兔氣管支架材料具有良好的生物相容性，同時其免疫原性降低，適合作為構(gòu)建組織工程氣管的支架材料。
目的構(gòu)建金黃色葡萄球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白 A（fibronectin binding protein A，F(xiàn)nBPA）r10-11 截短體融合蛋白的原核表達菌株并研究其免疫原性。 方法采用重組聚合酶鏈反應（ploymerase chain reaction，PCR）技術從金黃色葡萄球菌 Newman 株全基因組序列中進行 PCR 擴增，對擴增產(chǎn)物進行純化，連接 T 載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5α 中進行克隆，提取重組后的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，并回收目的片段連接到 pET-32a 質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21（DE3）中進行原核表達，采用 HIS 蛋白純化柱純化截短蛋白 FnBPAr10-11，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE ）鑒定，純化后的 FnBPAr10-11 用于免疫小鼠［分為無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）組、FnBPA 組、FnBPAr10-11 組］，檢測小鼠血清免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）水平、細胞因子水平、免疫保護率。 結(jié)果SDS-PAGE 分析顯示，表達后的蛋白相對分子質(zhì)量約為 33.1×103。FnBPAr10-11 組與 FnBPA 組 IgG 抗體效價達 1∶128 000，與 PBS 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。FnBPAr10-11 組的細胞因子水平與 FnBPA 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與 PBS 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。攻毒試驗中 FnBPAr10-11 組的免疫保護作用在 50% 以上。 結(jié)論成功構(gòu)建了金黃色葡萄球菌 FnBPAr10-11 截短體融合蛋白的原核表達菌株，該截短蛋白免疫原性良好。