目的 總結(jié)異種移植的研究現(xiàn)狀與進展。方法 復習國內(nèi)外關(guān)于異種移植研究的相關(guān)文獻并進行綜述。結(jié)果 超急性異種排斥反應是異種移植面臨的巨大問題，器官或組織的供體經(jīng)過基因修飾后，在一定程度上可以減輕超急性異種排斥反應。由于不同的器官具有不同的特性，目前異種器官移植移植物的存活時間存在較大差異。結(jié)論 通過對相關(guān)異種移植實驗研究的分析，可以全面地了解異種移植的研究背景，為異種移植提供合適的研究方向。將經(jīng)基因修飾的動物作為異種器官或組織的供體，有望使移植物避免或減輕超急性異種排斥反應。
目的 建立生長激素促分泌素受體(ghrelin receptor，GHS-R)基因敲除小鼠胚胎干細胞（ES細胞）雜合子模型，為研究GHS-R基因的功能奠定基礎(chǔ)。方法 用TK-neo置換原X-pPNT載體的PGK-neo構(gòu)建目標載體。以小鼠基因組DNA為模板, 用PCR方法擴增2條同源臂，將其按照一定方向裝入含有TK-neo的X-pPNT載體，并測序鑒定。載體線性化及純化后電穿孔轉(zhuǎn)染小鼠ES細胞，用G418和更昔洛韋(Gancyclovir)對電穿孔轉(zhuǎn)染后的ES細胞進行正、負篩選培養(yǎng)，得到雙藥抗性ES細胞，克隆后抽提基因組DNA，分別用PCR方法鑒定2條同源臂，并測序確定成功同源重組的ES細胞克隆。結(jié)果 改建X-pPNT載體成功，PCR獲得2條同源臂片段，測序正確，并按一定方向裝入打靶載體，ES細胞轉(zhuǎn)染后經(jīng)雙藥篩選得到328個陽性ES細胞克隆，PCR及測序鑒定證實3個克隆發(fā)生同源重組。結(jié)論 本研究成功獲得了GHS-R(－/+)雜合子小鼠ES細胞克隆，為進一步通過顯微注射及雜交育種獲得GHS-R基因敲除小鼠打下了基礎(chǔ)。
目的 探討在低血清胰島素樣生長因子-1（IGF-1）水平與正常IGF-1水平的小鼠乳腺癌模型中應用血管生長抑制劑人參皂甙（GS）Rg3后，IGF-1對血管生成的影響。方法 應用7，12-二甲基苯蒽（DMBA）誘導肝臟特異性IGF-1基因敲除鼠（LID鼠）及對照鼠建立原發(fā)乳腺癌模型，應用GS Rg3進行干預治療，利用免疫組化法檢測乳腺癌組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和Ⅷ因子相關(guān)抗原（F8-RAg）表達水平，同時利用基因芯片技術(shù)檢測小鼠乳腺癌及正常乳腺組織中相關(guān)基因的表達情況。結(jié)果 LID鼠乳腺癌的發(fā)生率低于對照鼠(P＜0.05)； LID鼠乳腺癌組織中VEGF表達水平與微血管密度均低于對照組(P＜0.05)。LID鼠乳腺癌組織中IGF-1、成纖維細胞生長因子(FGF)-1、肝細胞生長因子(HGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1基因較對照組上調(diào)，成纖維細胞生長因子受體(FGFR)-2、血小板源性生長因子(PDGF)-A和PDGF-B基因較對照組下調(diào)； 應用GS Rg3后，LID鼠乳腺癌組織中VEGFa、表皮生長因子(EGF)、表皮生長因子受體(EGFR)、PDGF-A和FGFR-2基因較對照組上調(diào)，而IGF-1和TGF-β1基因較對照組下調(diào)。結(jié)論 IGF-1促進小鼠乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，且與血管生長密切相關(guān)。血管生長抑制劑可能通過IGF-1及TGF-β1發(fā)揮抗腫瘤作用。
腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）與肝癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。然而這方面的研究大都是基于體外細胞實驗或小鼠移植瘤模型開展的。本文介紹一個運用白蛋白啟動子驅(qū)動 Cre（Alb-Cre）轉(zhuǎn)基因，通過基因重組技術(shù)成功構(gòu)建基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre 的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，肝臟特異表達的 Cre 重組酶在轉(zhuǎn)基因小鼠中實現(xiàn)對肝臟 AMPKα1 特異性高效敲除。肝臟 AMPKα1 敲除后不影響小鼠的生長、繁殖及肝臟的結(jié)構(gòu)。肝臟特異敲除 AMPKα1 小鼠模型的成功構(gòu)建，為實現(xiàn)在動物整體水平對 AMPK 與肝臟代謝或肝癌的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系等方面的研究提供了基礎(chǔ)。
目的觀察視網(wǎng)膜Müller細胞條件性基因敲除血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）對氧誘導視網(wǎng)膜病變（OIR）小鼠的影響。方法應用Cre-Loxp重組酶技術(shù)建立Müller細胞條件性基因敲除VEGF小鼠。Cre陽性為敲除VEGF（CKO）小鼠，Cre陰性為未敲除VEGF（NKO）小鼠。CKO小鼠（CKO組）、NKO小鼠（NKO組）各取20只建立OIR模型，觀察兩組小鼠在建模過程中的死亡率。小鼠17日齡時，行熒光血管造影視網(wǎng)膜鋪片觀察小鼠視網(wǎng)膜血管形態(tài)，計算無血管區(qū)面積占全視網(wǎng)膜面積的百分比；行視網(wǎng)膜石蠟切片蘇木精伊紅染色計數(shù)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)；免疫熒光組織化學染色觀察小鼠視網(wǎng)膜中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達。結(jié)果OIR建模過程中，CKO組、NKO組小鼠總死亡率分別為65.00%、30.00%；兩組小鼠總死亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義（x2=4.912，P=0.027）。CKO組小鼠視網(wǎng)膜正常血管化推遲，可見大片無血管區(qū)，新生血管叢少見，整個視網(wǎng)膜單薄、無層次感；NKO組小鼠視網(wǎng)膜正常血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可見范圍較大，血管密度較高，新生血管叢多見，熒光素滲漏較明顯。CKO組、NKO組小鼠視網(wǎng)膜無血管區(qū)面積占全視網(wǎng)膜面積的百分比分別為（28.31±11.15）%、（16.82±7.23）%；兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.734，P=0.014）。CKO組、NKO組小鼠平均每張切片突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細胞核數(shù)分別為（26.10±6.37）、（28.80±7.59）個；兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.437，P=0.016）。CKO組、NKO組小鼠視網(wǎng)膜均可見HIF-1α呈陽性表達，主要位于神經(jīng)節(jié)細胞層和光感受器細胞層；CKO組小鼠視網(wǎng)膜HIF-1α陽性表達強于NKO組。結(jié)論Müller細胞條件性基因敲除VEGF明顯減弱新生小鼠在OIR環(huán)境中的生存能力，抑制部分視網(wǎng)膜新生血管的同時推遲了視網(wǎng)膜正常血管化。
目的 利用 Red 同源重組的方法構(gòu)建大腸桿菌外膜蛋白 A （outer membrane protein-A，OmpA）基因缺失株，為后續(xù)研究奠定一定的基礎(chǔ)。 方法 以已知大腸桿菌 OmpA 為靶點在其兩端設計同源臂引物，以質(zhì)粒 pKD3 為模板利用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增出氯霉素篩選標記序列，然后采用 Red 重組技術(shù)利用質(zhì)粒 pKD46 誘導表達的重組酶通過電擊的方法把外源構(gòu)建打靶片段導入大腸桿菌，構(gòu)建大腸桿菌 OmpA 基因缺失突變株。以菌落 PCR 方法檢測基因大小，以蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達情況，以重組菌株培養(yǎng)過程的吸光度（A600 ）值來反映重組子的生長情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建了大腸桿菌 OmpA 基因缺失突變株，通過蛋白質(zhì)印跡法檢測和細菌生長曲線測定，發(fā)現(xiàn) OmpA 基因成功完全丟失，突變株的生長曲線與野生型的差異不顯著。 結(jié)論 OmpA 基因缺失對大腸桿菌的生長無顯著影響，為進一步研究疫苗活載體提供了一定基礎(chǔ)。
規(guī)律性短重復回文序列簇（CRISPR）和 CRISPR 輔助蛋白 9（Cas9）構(gòu)成的 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)快速推進了基因修飾豬作為醫(yī)學研究模式動物的廣泛應用。而高效的靶基因單鏈向?qū)?RNA（sgRNA）是利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)進行基因編輯成功的關(guān)鍵，對于豬等繁殖周期較長的大動物，則需要在實施動物實驗前，在體外篩選出高效的 sgRNA 以避免時間和資源成本浪費。另外，如何高效獲得陽性基因編輯單克隆細胞是目前尚待解決的難題。本研究建立了靶向豬基因組的 sgRNA 快速篩選方法，利用熒光載體富集基因編輯細胞，同時探索利用圖案微陣列培養(yǎng)技術(shù)快速獲得單克隆細胞的方法，在此基礎(chǔ)上高效獲得延胡索酰乙酰乙酸酶（Fah）基因編輯細胞，為后續(xù)生產(chǎn)作為人類肝細胞生物反應器的Fah基因敲除豬奠定基礎(chǔ)。
目的探索 GGTA1 基因敲除豬胰島細胞移植到Ⅰ型糖尿病猴的效果。方法本研究采用 GGTA1 基因敲除新生豬胰島細胞開展了 3 例豬-猴異種胰島移植實驗。結(jié)果3 只獼猴成功進行胰島細胞移植治療，術(shù)后生命體征平穩(wěn)，未發(fā)生靜脈栓塞癥狀。移植后血糖和外源胰島素用量均顯著降低，能檢測到特異性豬 C 肽。移植后 3 只獼猴均發(fā)生了酮癥酸中毒癥狀，1 只獼猴發(fā)生傷口感染，經(jīng)對癥處理后均健康存活達 16 周。結(jié)論GGTA1 基因敲除新生豬胰島細胞經(jīng)肝門靜脈移植治療 1 型糖尿病的方法是有效的。