目的 以去細胞肌肉生物支架（acellular muscle bioscaffolds，AMBS）接種BMSCs，同種異體移植修復大鼠脊髓半切損傷，觀察兩者聯(lián)合移植對脊髓損傷的修復作用。 方法取8周齡雌性SD大鼠，采用改良化學方法制備AMBS，并進行復合冷滅菌；密度梯度離心法提取、貼壁法培養(yǎng)BMSCs，取第3代細胞用Hoechst 33342熒光標記，采用注射法制備BMSCs-AMBS復合支架，14 d后掃描電鏡及熒光顯微鏡觀察其生物相容性。取成年雌性SD大鼠48只，制備T9～11脊髓半切損傷模型后隨機分為4組（n=12），A組于缺損處移植BMSCs-AMBS復合支架，B組單獨移植BMSCs，C組單獨移植AMBS，D組注射PBS作為空白對照組，分別于術(shù)后1、2、3、4周行運動功能評分，術(shù)后4周行HE染色觀察及免疫熒光檢測。 結(jié)果Masson染色及HE染色示AMBS內(nèi)部呈平行結(jié)構(gòu)，主要為膠原纖維，幾乎無肌纖維。BMSCs-AMBS復合培養(yǎng)14 d后熒光顯微鏡觀察示Hoechst 33342標記BMSCs大量存活，掃描電鏡可見BMSCs貼附于支架內(nèi)表面生長。術(shù)后2～4周，大鼠BBB評分A組均高于其余3組（P lt; 0.05），D組明顯低于其余3組（P lt; 0.05）；術(shù)后4周B組明顯高于C組（t=10.352，P=0.000）。術(shù)后4周，HE染色示脊髓空洞面積A組明顯小于其余3組，免疫熒光染色示A 組神經(jīng)絲蛋白200、巢蛋白陽性細胞表達量高于其余3組，神經(jīng)膠質(zhì)原酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）則明顯低表達。A、B組熒光示蹤的BMSCs移植到體內(nèi)后主要遷移至對側(cè)灰質(zhì)前角，部分分化為神經(jīng)元樣細胞。A、B、C、D組GFAP熒光半定量分析積分吸光度（IA）值分別為733.01 ± 202.04、926.42 ± 59.46、1 069.37 ± 33.42、1 469.46 ± 160.53，A組明顯低于其余3組，D組高于其余3組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）。 結(jié)論AMBS具有相對規(guī)則的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，與BMSCs有良好生物相容性，能抑制膠質(zhì)瘢痕，促進BMSCs存活、遷徙、分化，是細胞移植理想的天然載體。兩者聯(lián)合移植修復大鼠脊髓損傷能發(fā)揮協(xié)同作用，促進運動功能恢復。
目的 研究殼聚糖 - 藻酸鹽支架復合 BMSCs 構(gòu)建組織工程脊髓，橋接大鼠脊髓半橫斷損傷斷端，促進急性脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）修復的作用。? 方法? 取 1 只成年雄性 SD 大鼠骨髓，分離、培養(yǎng) BMSCs。采用冷凍干燥法制備殼聚糖 - 藻酸鹽支架，掃描電鏡觀察結(jié)構(gòu)，用浸提液實驗檢測毒性。將支架材料與第 2 代 BMSCs 以細胞密度 1 × 106個 /mL 體外復合培養(yǎng)制備組織工程脊髓，于培養(yǎng)后 1、 3、 5 d 掃描電鏡觀察其生物相容性。取成年雌性 SD 大鼠40 只制備急性脊髓 T9 半橫斷損傷模型，根據(jù)修復方法不同隨機將大鼠分為 4 組（n=10）。A 組于損傷區(qū)植入組織工程脊髓， B 組植入單純支架， C 組植入 20 μL 1 × 107個 /mL BMSCs， D 組直接縫合硬膜作為空白對照。術(shù)后 1、 2、 4、 6 周采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分評價大鼠后肢運動功能；術(shù)后 6 周取材行麥芽凝集素 - 辣根過氧化物酶（wheat germ agglutinin-horseradish peroxidase，WGA-HRP）神經(jīng)逆行示蹤檢測、 HE 染色和免疫熒光染色檢測。? 結(jié)?果 掃描電鏡觀察示殼聚糖 - 藻酸鹽支架呈三維多孔海綿樣結(jié)構(gòu)。浸提液實驗顯示支架材料的細胞毒性等級為 0 ～ 1 級。掃描電鏡觀察示 BMSCs 與支架材料復合培養(yǎng) 3 d 后即可黏附于支架材料表面，細胞呈一定方向排列。術(shù)后 2、 4、 6 周 A 組 BBB 評分均明顯高于其余各組，D 組明顯低于其余各組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05）； B 組術(shù)后 4、6 周高于 C 組（P lt; 0.05）。術(shù)后 6 周，各組 WGA-HRP 神經(jīng)逆行示蹤檢測示陽性神經(jīng)纖維均未能穿過脊髓斷端。HE 染色與免疫熒光染色顯示 A 組宿主脊髓與組織工程脊髓連接緊密，損傷區(qū)內(nèi)無明顯瘢痕組織長入，有較多神經(jīng)絲蛋白 200（neuroflament 200，NF-200）陽性細胞發(fā)生的神經(jīng)纖維及神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specifc enolase， NSE）陽性神經(jīng)元樣細胞； B 組支架植入外周可見成纖維細胞形成的瘢痕組織以及少量侵入尚未降解的支架材料；交界區(qū)可見少量 NSE、NF-200 陽性細胞； C、D 組脊髓斷端見瘢痕組織填充， D組脊髓損傷周邊有空洞形成，兩組均未見明顯NSE、 NF-200陽性神經(jīng)元樣細胞。? 結(jié)?論 殼聚糖-藻酸鹽支架與 BMSCs 復合構(gòu)建的組織工程脊髓對大鼠急性 SCI 修復有促進作用，是一種具有潛在應用前景的支架材料。
目的 觀察經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔不同次數(shù)移植的 BMSCs 在 Wistar 大鼠損傷脊髓內(nèi)的存活、遷移及對大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）修復的作用，探討 BMSCs 移植的最佳次數(shù)。? 方法 8 只 2 月齡 Wistar 大鼠，體重約120 g。取股骨骨髓體外分離培養(yǎng)第 2 代 BMSCs，用 Hoechst 33342 標記。另取 75 只成年 Wistar 大鼠體重約 220 g，采用改良Allen法制備T9、 10 SCI模型。隨機分為5組（n=15）， A組經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔置管移植1次1 × 107個/mL BMSCs懸液0.1 mL（術(shù)后 1 周）， B 組 2 次（術(shù)后 1、 3 周）， C 組 3 次（術(shù)后 1、 3、 5 周）， D 組 5 次（術(shù)后 1、 3、 5、 7、 9 周）， E 組于術(shù)后 1、 3、 5、 7、9 周各注入 0.2 mL PBS 作為空白對照。SCI 術(shù)后不同時間點行大鼠后肢 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分評價神經(jīng)功能狀況，并行熒光顯微鏡、 HE 染色、免疫組織化學染色觀察 BMSCs 在體內(nèi)遷移、存活及分化情況。? 結(jié)果 術(shù)后 3 周，A ～ D 組 BBB 評分均有明顯增加，與 E 組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。術(shù)后 7、9、12 周，C、D 組 BBB 評分均明顯高于 A、B 組（P lt; 0.01），B 組高于 A 組（P lt; 0.01）。各時間點 C、D 組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。熒光顯微鏡觀察示術(shù)后 3 周，移植的 BMSCs 存活于損傷脊髓邊緣， A 組細胞數(shù)達高峰；隨后 A 組細胞數(shù)逐漸減少， B、 C、 D 組分別于術(shù)后5、 7、 7周細胞數(shù)達高峰后逐漸下降。12周C、 D組存活細胞數(shù)顯著多于A、 B組，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；各時間點C、 D組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。 HE染色示術(shù)后3周損傷脊髓形成的空洞A、 B、 C、 D組逐漸減小，12 周 C、 D 組空洞最小， A、 B 組次之， E 組最大。免疫組織化學染色示神經(jīng)絲蛋白 200（neuroflament 200， NF-200）細胞數(shù)變化趨勢與 BMSCs 存活細胞數(shù)類似。術(shù)后 12 周 NF-200 陽性細胞數(shù)在 C、D 組表達較 A、B 組明顯；神經(jīng)元樣細胞發(fā)出的神經(jīng)絲穿過損傷區(qū)在C、 D組最明顯， A、 B組較少。 ? 結(jié)論 多次移植BMSCs更有利于SCI修復，移植以3次為最好。
目的 脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）能分化成神經(jīng)元促進脊髓愈合，但其分子機制尚不清楚。研究三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）/ 信號轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)導激活因子 3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）通路在 SCI 中的生理和病理機制。? 方法 取 96 只健康成年雌性 SD 大鼠，體重 250 ～ 300 g，隨機分為 4 組（n=24）： A、 B、 C 組用改良 Allen 重物打擊法制作 T8 ～ 10 SCI 模型后， A 組以 ATP（40 mg/kg）、 B 組以等量生理鹽水、 C 組以 ATP（40 mg/ kg）加雷帕霉素（3 mg/kg）分別治療 7 d； D 組僅行椎板切除術(shù)，不損傷脊髓，等量生理鹽水治療 7 d。術(shù)后1、2、3、4 周采用 Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分法評估大鼠后肢運動功能恢復情況，各時間點取材行免疫組織化學、Western blot、實時熒光定量 PCR 檢測脊髓細胞標志物神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specifc enolase，NSE）、巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)（glial fbrillary acidic protein， GFAP）和通路因子mTOR、 STAT3的表達。? 結(jié)果 術(shù)后 1 ～ 4 周，A 組大鼠 BBB 評分呈持續(xù)升高趨勢，均高于 B、C 組，低于 D 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。實時熒光定量 PCR 檢測顯示，術(shù)后 1 ～ 4 周 A 組 mTOR、STAT3、NSE mRNA 表達持續(xù)升高，Nestin mRNA 表達逐漸降低，但各時間點均高于 B、C、D 組，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；而 A 組 GFAP mRNA 表達持續(xù)升高，但各時間點均低于 B、C組，高于 D 組，差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；各時間點 B、C 組各指標 mRNA 表達與 D 組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01），?B、C 組間 mTOR、P-mTOR、STAT3、P-STAT3 mRNA 比較差異有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.05），余指標表達差異無統(tǒng)計學意義（P gt; 0.05）。Western blot蛋白檢測結(jié)果與mRNA變化相似。? 結(jié)論 在大鼠體內(nèi)ATP能激活mTOR/STAT3通路，誘導內(nèi)源性 NSCs 增殖、分化為神經(jīng)元，有助于 SCI 愈合。
【摘 要】 目的 探討傳統(tǒng)中藥紅景天苷誘導大鼠BMSCs 向膽堿能神經(jīng)細胞分化的作用及影響，以期為紅景天苷應用于干細胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。 方法 取4 ～ 6 周齡Wistar 大鼠（體重約120 g）2 只分離、培養(yǎng)BMSCs，并采用流式細胞儀鑒定。取第2 代細胞，根據(jù)誘導方法不同將實驗分為紅景天苷誘導組（A 組）、維甲酸誘導組（B 組）和空白對照組（C 組），A、B 組BMSCs 分別采用紅景天苷（20 μg/mL）和維甲酸（5 μmol/mL）誘導培養(yǎng)1、3、6、9 d，MTT 法檢測細胞增殖活力；細胞免疫熒光染色檢測神經(jīng)細胞相關(guān)標志分子神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specificenolase，NSE）、神經(jīng)微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）、β- 微管蛋白Ⅲ（β-Tubulin Ⅲ）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、乙酰膽堿（Acetylcholine, Ach）及NGF 的表達；RT-PCR 檢測NSE、β-Tubulin Ⅲ、GFAP、γ- 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、 腦源性神經(jīng)生長因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF） mRNA 的表達；ELISA 法測定培養(yǎng)液中BDNF 和NGF 含量；Western blot 檢測NGF 蛋白表達水平。 結(jié)果 流式細胞儀檢測顯示，CD90 和CD106 陽性，CD34 和CD45 陰性，實驗細胞為BMSCs。A、B 組誘導培養(yǎng)6 d 和9 d，細胞增殖活力較C 組明顯增強（P lt; 0.05）。RT-PCR 檢測示，A 組誘導培養(yǎng)6 d，NSE、BDNF、β-Tubulin Ⅲ、GFAP mRNA 表達豐度上調(diào)至峰值。B 組誘導培養(yǎng)6 d，NSE mRNA 表達豐度上調(diào)至峰值；1 d 時BDNF mRNA 表達豐度上調(diào)，6 d 時達峰值；3 d 時β-Tubulin Ⅲ mRNA 表達豐度上調(diào)至峰值；1 d 時 GFAP mRNA 表達豐度達峰值，與其余各時間點及C 組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。各組各時間點均未見GABA mRNA 表達。細胞免疫熒光染色示，誘導培養(yǎng)3 d，A、B 組NSE、MAP2、β-Tubulin Ⅲ和GFAP 陽性率與C 組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）；A、B 組誘導培養(yǎng) 3、6、9 d，Ach 陽性率均高于誘導培養(yǎng)1 d 時及C 組陽性率（P lt; 0.01）；A、B 組各時間點NGF 陽性率均顯著高于C 組（P lt; 0.01）。ELISA 法檢測顯示，A、B 組誘導培養(yǎng) 1、3、6、9 d 時，BDNF、NGF 表達水平均較C 組上調(diào)（P lt; 0.01），各時間點A、B 組間BDNF 表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P lt; 0.01）。Western blot 檢測顯示，A 組誘導培養(yǎng)6 d、B 組誘導培養(yǎng)3 d 時 NGF 蛋白表達最高。 結(jié)論 紅景天苷能定向誘導大鼠BMSCs 分化為膽堿能神經(jīng)細胞。