目的基于低溫沉積3D打印技術(shù)構(gòu)建新型組織工程半月板支架，評(píng)價(jià)該支架理化性質(zhì)及生物相容性。方法 取新鮮豬膝關(guān)節(jié)半月板，采用改良物理化學(xué)聯(lián)合方法脫細(xì)胞處理，獲得脫細(xì)胞半月板基質(zhì)勻漿；經(jīng)大體觀察、HE及DAPI染色觀察脫細(xì)胞效果，甲苯胺藍(lán)、番紅O及天狼猩紅染色評(píng)估黏多糖和膠原保留情況。然后制備脫細(xì)胞半月板基質(zhì)生物墨水，通過低溫沉積3D打印技術(shù)制備新型組織工程半月板支架。掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)；與脂肪來源干細(xì)胞共培養(yǎng)后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）檢測(cè)支架細(xì)胞相容性，死/活細(xì)胞染色和細(xì)胞骨架染色觀察細(xì)胞活性和形態(tài)；植入大鼠皮下后組織學(xué)染色評(píng)估支架炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與降解情況。結(jié)果 脫細(xì)胞處理后半月板基質(zhì)勻漿呈透明凝膠狀，DAPI和組織學(xué)染色示免疫原性的核酸去除，同時(shí)黏多糖及膠原成分保留。采用低溫沉積3D打印技術(shù)成功構(gòu)建新型組織工程半月板支架，掃描電鏡示支架呈分級(jí)大孔-微孔的微觀結(jié)構(gòu)；CCK-8檢測(cè)示支架具有良好細(xì)胞相容性；死/活細(xì)胞染色示支架可有效維持細(xì)胞活性（>90%）；細(xì)胞骨架染色示支架有利于細(xì)胞黏附和鋪展；支架植入大鼠皮下1周后有輕度炎癥反應(yīng)，3周后未見明顯炎癥反應(yīng)，并可見支架逐步降解。結(jié)論基于低溫沉積3D打印技術(shù)構(gòu)建的新型組織工程半月板支架具有分級(jí)大孔-微孔的微觀結(jié)構(gòu)和良好細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞黏附和生長(zhǎng)，為下一步體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。
目的 細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）因其良好的生物安全性和生物相容性，以及具有細(xì)胞識(shí)別及黏附位點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)而廣泛用作組織工程支架材料。探討神經(jīng)來源天然ECM 的制備方法及用于神經(jīng)組織工程支架的可行性。 方法 收集新鮮犬坐骨神經(jīng)10 根，采用低滲凍融、機(jī)械粉碎、差速離心法制備神經(jīng)ECM。采用掃描電鏡觀察其形態(tài)特征；Ⅰ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白免疫熒光染色觀察其組成成分，并用Hoechst33258 熒光染色檢測(cè)其去細(xì)胞程度；行天狼猩紅、番紅O、甲苯胺藍(lán)染色，對(duì)其成分進(jìn)行定性分析；采用生化定量檢測(cè)神經(jīng)ECM 中總膠原和葡萄糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）的含量；將大鼠背根神經(jīng)節(jié)和大鼠雪旺細(xì)胞分別與神經(jīng)ECM 膜共培養(yǎng)，采用免疫熒光染色觀察神經(jīng)組織以及細(xì)胞在ECM 膜上的生物相容性。 結(jié)果 掃描電鏡觀察示神經(jīng)ECM 為直徑30 ～ 130 nm 的二維納米微絲。免疫熒光染色示Ⅰ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白染色均呈陽性；Hoechst33258 熒光染色提示神經(jīng)ECM 去細(xì)胞完全。組織化學(xué)染色示天狼猩紅、番紅O、甲苯胺藍(lán)染色均呈陽性。生化成分定量檢測(cè)神經(jīng)ECM 總膠原含量為（114.88 ± 13.33）μg/mg 干重，與正常神經(jīng)組織的（54.07 ± 5.06） μg/ mg 干重比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.01）；神經(jīng)ECM 的GAG 含量為（17.52 ± 2.34）μg/mg 干重，與正常神經(jīng)組織的（25.25 ± 1.56） μg/mg 干重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。大鼠背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)7 d 后，可見神經(jīng)絲蛋白200 免疫熒光染色呈陽性；大鼠雪旺細(xì)胞培養(yǎng)2 d 后，可見S100 免疫熒光染色呈陽性。 結(jié)論 神經(jīng)ECM 富含Ⅰ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等成分，具有良好的細(xì)胞相容性，可作為一種理想的神經(jīng)組織工程支架材料。
目的 探討化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)復(fù)合緩釋神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的效果。 方法 采用藥物微球技術(shù)制備NGF 微球，與生物纖維蛋白膠混合形成NGF 復(fù)合緩釋制劑。取健康雄性SD 大鼠20 只，體重280 ～ 300 g，制備化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)。取健康雄性Wistar 大鼠52 只，體重250 ～ 300 g，制備大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)10 mm 缺損模型。根據(jù)修復(fù)缺損材料不同，隨機(jī)分成4 組（n=13）：自體神經(jīng)移植組（A 組）、化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)移植加NGF 復(fù)合緩釋制劑組（B 組）、化學(xué)去細(xì)胞異體神經(jīng)移植組（C 組）和化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植和纖維蛋白膠組（D 組）。右側(cè)不作處理作為空白對(duì)照組。術(shù)后行大體觀察；術(shù)后2 周測(cè)量神經(jīng)軸突生長(zhǎng)距離；術(shù)后16 周行電生理檢測(cè)，計(jì)算術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率、術(shù)側(cè)小腿三頭肌收縮力恢復(fù)率及濕重恢復(fù)率，并行移植神經(jīng)吻合中段HE 和半薄切片甲苯胺藍(lán)染色觀察。 結(jié)果 所有動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成，切口愈合良好。術(shù)后2 周A 組神經(jīng)再生距離較其余3 組長(zhǎng)（P lt; 0.05），B 組優(yōu)于C、D 組（P lt; 0.05），C、D 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。術(shù)后16 周，A、B、C、D 組術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度恢復(fù)率分別為73.37% ± 7.82%、70.39% ± 8.45%、53.51% ± 6.31%、55.28% ± 5.37%；A、B 組與C、D 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05）。A、B、C、D 組術(shù)側(cè)小腿三頭肌收縮力恢復(fù)率分別為85.33% ± 5.59%、69.79% ± 5.31%、64.46% ± 8.49%、63.35% ± 6.40%；A 組與B、C、D 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），B、C、D 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。A、B、C、D 組術(shù)側(cè)小腿三頭肌濕重恢復(fù)率分別為62.54% ± 8.25%、53.73% ± 4.56%、46.37% ± 5.68%、45.78% ± 7.14%；A 組與B、C、D 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），B 組與C、D 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P lt; 0.05），C、D 組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P gt; 0.05）。組織學(xué)圖像分析示B 組有髓神經(jīng)纖維數(shù)量、軸突直徑及髓鞘厚度均優(yōu)于C、D 組（P lt; 0.05），B 組軸突直徑小于A 組（P lt; 0.05）。 結(jié)論 復(fù)合緩釋NGF 的化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)能滿意修復(fù)一定長(zhǎng)度的周圍神經(jīng)缺損，是一種有效的周圍神經(jīng)組織工程修復(fù)材料。
目的比較鎂合金與聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]在體內(nèi)降解情況，同時(shí)采用Micro-CT深入研究鎂合金體內(nèi)降解規(guī)律。 方法取3月齡雄性新西蘭大白兔40只，分別于右側(cè)和左側(cè)股骨髁鉆孔植入40個(gè)表面微弧氧化處理的AZ31鎂合金棒（鎂棒）和40個(gè)PLGA棒。術(shù)后4、8、12、16周各處死10只動(dòng)物，取出雙側(cè)股骨髁，采用Micro-CT掃描及生成數(shù)據(jù)定量評(píng)價(jià)植入物降解情況；然后取出植入物清洗、烘干后稱重，與術(shù)前重量差值作為植入物降解量；HE染色觀察局部炎性反應(yīng)情況。并將鎂合金的失重情況與Micro-CT的評(píng)價(jià)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。 結(jié)果Micro-CT掃描示，PLGA棒不顯影。術(shù)后4周鎂棒幾乎無降解痕跡，有少量腐蝕點(diǎn)；術(shù)后8周在4周原有腐蝕點(diǎn)基礎(chǔ)上逐步擴(kuò)大，縱軸與橫截面交界邊緣變得模糊；至術(shù)后16周鎂棒表面腐蝕面積更大，邊緣已不連續(xù)。Micro-CT定量分析示：術(shù)后4、8周鎂棒體積分?jǐn)?shù)下降緩慢；術(shù)后12、16周較術(shù)后4、8周降低明顯，16周最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。術(shù)后隨時(shí)間延長(zhǎng)鎂礦物密度持續(xù)降低，12～16周降低速度最快，第8周后各時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；而鎂CT圖像密度隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)變化很?。≒>0.05）。術(shù)后隨時(shí)間延長(zhǎng)鎂棒表面積與體積比持續(xù)增加，術(shù)后12、16周明顯高于4、8周，且16周高于12周（P < 0.05）。術(shù)后隨時(shí)間延長(zhǎng)，鎂棒表面腐蝕點(diǎn)越來越多，導(dǎo)致橫截面半徑減小，即平均骨小梁厚度逐漸降低，8周后各時(shí)間點(diǎn)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。失重法檢測(cè)示：術(shù)后隨時(shí)間延長(zhǎng)，兩種材料降解量均逐漸增加（P < 0.05）；術(shù)后8、12周，鎂棒降解量均顯著低于PLGA棒（P < 0.05），但術(shù)后16周時(shí)鎂棒降解量已超過PLGA棒。將各時(shí)間點(diǎn)鎂棒質(zhì)量分?jǐn)?shù)與Micro-CT方法得出的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩個(gè)指標(biāo)的變化趨勢(shì)相近，但各時(shí)間點(diǎn)鎂棒質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于體積分?jǐn)?shù)，且在第8、12、16周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。HE染色示，術(shù)后4周鎂棒周圍可見輕度炎性反應(yīng)，但隨時(shí)間延長(zhǎng)炎性反應(yīng)逐漸減輕，至16周時(shí)已未見炎性反應(yīng)；而PLGA周圍一直無炎性反應(yīng)。 結(jié)論采用Micro-CT檢測(cè)鎂合金降解情況具有無創(chuàng)、可活體檢測(cè)、定量、精確的優(yōu)勢(shì)。鎂合金和PLGA在體內(nèi)均隨時(shí)間推移而逐步腐蝕，經(jīng)歷先緩慢后加速的持續(xù)降解過程；PLGA在體內(nèi)降解則更早、更快，至16周時(shí)鎂合金降解量已超過PLGA，鎂合金密度在降解過程中無明顯變化。鎂合金在金屬與原骨之間產(chǎn)生新生骨橋欠充分，仍缺乏足夠的無縫連接能力。
目的 采用化學(xué)去細(xì)胞法處理犬顱外段全面神經(jīng)的免疫原性成分，通過不同組織學(xué)染色，對(duì)化學(xué)去細(xì)胞神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和雪旺細(xì)胞、髓鞘殘留情況進(jìn)行觀察。 方法 雜種犬10 只，體重（18 ± 3）kg，處死后取新鮮犬頭顱10 個(gè)，解剖、分離犬顱外段雙側(cè)面神經(jīng)主干及各分支（顳支、顴支、頰支、下頜緣支、頸支），共20 根。將20 根犬全面神經(jīng)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n=12）和對(duì)照組（n=8）。參照Sondell 法，用3%TritonX-100 和4% 脫氧膽酸鈉溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)組犬全面神經(jīng)進(jìn)行化學(xué)萃??；對(duì)照組不作處理。對(duì)兩組面神經(jīng)分別行HE 染色、Hoechst33258 熒光染色及雪旺細(xì)胞P75、髓鞘相關(guān)蛋白Zero、層粘連蛋白（Laminin）免疫熒光組織化學(xué)染色觀察。 結(jié)果 各種組織學(xué)染色觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組面神經(jīng)主要免疫原性物質(zhì)、雪旺細(xì)胞和髓鞘均徹底去除，促神經(jīng)生長(zhǎng)成分Laminin 保留，且神經(jīng)結(jié)構(gòu)保存完好。實(shí)驗(yàn)組犬面神經(jīng)主干及5 個(gè)分支具有相似的觀察結(jié)果。 結(jié)論 化學(xué)去細(xì)胞處理后的犬全面神經(jīng)，具有良好的天然面神經(jīng)一主干五分支結(jié)構(gòu)，可能是修復(fù)全面神經(jīng)缺損的良好移植物。
目的介紹一種不脫鈣骨組織的冰凍切片法，通過觀察骨和軟骨內(nèi)的熒光分布，探討該方法的可行性。 方法取健康成年雄性綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因SD大鼠膝關(guān)節(jié)，經(jīng)包埋劑包埋，置于冰凍切片機(jī)中，將表面涂有合成橡膠的薄膜黏附于包埋塊表面，行膝關(guān)節(jié)組織切片。熒光顯微鏡及光鏡下觀察切片組織內(nèi)熒光表達(dá)及結(jié)構(gòu)；并行Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫熒光染色和HE、甲苯胺藍(lán)、茜素紅染色，觀察軟骨及骨的結(jié)構(gòu)及熒光分布特征。 結(jié)果制備的大鼠膝關(guān)節(jié)冰凍切片厚度均為6 μm，大體觀察示關(guān)節(jié)各結(jié)構(gòu)均完整切割，光鏡下能清晰分辨切片軟骨各層細(xì)胞形態(tài)以及軟骨下骨、骨小梁排列走行。熒光顯微鏡下觀察，可見關(guān)節(jié)周圍軟組織、軟骨及骨組織呈綠色熒光，Ⅰ型膠原在骨組織表達(dá)，Ⅱ型膠原在軟骨組織表達(dá)。HE染色及甲苯胺藍(lán)染色能清晰分辨軟骨層形態(tài)結(jié)構(gòu)。茜素紅染色示軟骨下骨板、半月板內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)完整，而且脛骨近端的皮質(zhì)骨連續(xù)性存在。 結(jié)論采用冰凍切片法制備不脫鈣骨組織切片，可直接觀察骨、軟骨組織內(nèi)熒光物質(zhì)的分布，縮短骨組織切片的制備周期。
目的利用靜電紡絲技術(shù)制備聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）/Ⅰ型膠原納米纖維取向性補(bǔ)片，對(duì)其進(jìn)行理化表征和生物性能評(píng)價(jià)，探討其作為肩袖修復(fù)人工合成材料的可行性。方法利用靜電紡絲技術(shù)分別使用質(zhì)量比 10%PCL 靜電紡絲溶液制備單純 PCL 納米纖維補(bǔ)片（對(duì)照組），以及含 25%Ⅰ型膠原的 PCL 混合靜電紡絲溶液制備 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維補(bǔ)片（實(shí)驗(yàn)組）。取兩種補(bǔ)片行大體及掃描電鏡觀察支架形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)并測(cè)量纖維直徑和孔隙率，行單軸拉伸試驗(yàn)檢測(cè)補(bǔ)片的力學(xué)性能，使用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀對(duì)補(bǔ)片成分進(jìn)行分析，測(cè)量補(bǔ)片表面接觸角。將兩種補(bǔ)片浸提液與第 3 代兔肌腱干細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒 8（cell counting kit 8，CCK-8）法檢測(cè)材料毒性和細(xì)胞增殖情況，以正常培養(yǎng)細(xì)胞作為空白對(duì)照組；將兔肌腱干細(xì)胞復(fù)合于兩種補(bǔ)片上，體外培養(yǎng) 3 d 后進(jìn)行死/活細(xì)胞染色，共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察細(xì)胞在補(bǔ)片上的黏附和活性。結(jié)果大體及掃描電鏡觀察示，兩種補(bǔ)片纖維均呈取向性排列，實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)片纖維直徑顯著小于對(duì)照組（t=26.907，P=0.000），孔隙率顯著大于對(duì)照組（t=2.506，P=0.032）。實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)片的纖維拉伸強(qiáng)度和楊氏模量均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.705，P=0.029；t=4.064，P=0.034）。紅外光譜分析示，實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)片中 PCL 和Ⅰ型膠原成功混合。實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)片表面接觸角為（73.88±4.97）°，為親水的；而對(duì)照組補(bǔ)片表面接觸角為（128.46±5.10）°，為疏水的；兩組表面接觸角比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.705，P=0.002）。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各組細(xì)胞吸光度（A）值均逐漸增加，各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 A 值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。共聚焦激光掃描顯微鏡觀察示，培養(yǎng) 3 d，兔肌腱干細(xì)胞在兩種補(bǔ)片表面均可黏附、生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)片表面黏附的細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，且活性更好。結(jié)論利用靜電紡絲技術(shù)制備的 PCL/Ⅰ型膠原納米纖維取向性補(bǔ)片具有優(yōu)良的理化性能及細(xì)胞黏附性能，無細(xì)胞毒性，未來可作為肩袖修復(fù)理想的組織工程補(bǔ)片。