目的 觀察可溶性fms-樣絡氨酸激酶受體-1（sFlt-1）基因胞外第2~3區(qū)和2~4區(qū)對缺氧、高糖環(huán)境下視網(wǎng)膜血管通透性及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白酶B（PI3K/Akt）之間信號通路的影響。方法 構(gòu)建真核表達質(zhì)粒編碼增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pcDNA3-1-EGFP）/sFlt-1（2~3）和pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1（2~4），采用酶切、電泳及基因測序鑒定。將實驗分為正常對照組、缺氧組和高糖組進行。以羧甲基化葡聚糖（CMD）納米磁顆粒為基因載體，分別攜帶兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染缺氧、高糖條件下培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（HUVEC）。采用分光光度計檢測各組兔視網(wǎng)膜血管對伊凡思藍（EB）染料的滲漏量。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）和免疫蛋白印跡（Western blot）法分別檢測各組細胞PI3K/Akt信號通路下游特異性磷酸化激酶Akt（p-Akt）mRNA和蛋白的表達。結(jié)果 缺氧組和高糖組注射轉(zhuǎn)染細胞上清液后，視網(wǎng)膜血管EB滲漏量較正常對照組明顯增加（t=2.476，2.515；P值均lt;0.01）。缺氧組和高糖組轉(zhuǎn)染了pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~3)和pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~4)后，視網(wǎng)膜血管EB滲漏量較未轉(zhuǎn)染明顯降低（t=2.598，2.679，2.386，2.732；P值均lt;0.01）。缺氧組、高糖組HUVEC p-Akt mRNA表達較正常對照組明顯上調(diào)（t=2.612，2.545；P值均lt;0.01），轉(zhuǎn)染pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~3)和pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~4)后明顯下調(diào)（t=2.512，2.189，2.372，2.687；P值均lt;0.01）。缺氧組和高糖組HUVEC p-Akt蛋白表達較正常對照組明顯上調(diào)（t=2.376，2.712；P值均lt;0.01），轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-EGFP/sFlt-1(2~3)和pcDNA3-1-EGFP/sFlt-1(2~4)后明顯下調(diào)（t=2.259，2.391，2.399，2.413；P值均lt;0.01）。結(jié)論 sFlt-1受體胞外第2~3區(qū)和2~4區(qū)均可抑制缺氧、高糖環(huán)境下的視網(wǎng)膜血管通透性增高和PI3K/Akt通路的信號傳導。
目的 研究磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）在人膀胱尿路上皮癌組織中的表達特征及臨床意義。 方法 2005年6月－2010年7月，采用免疫組織化學法檢測40例膀胱尿路上皮癌組織及10例正常膀胱組織PI3K與p-Akt的表達，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果 PI3K和p-Akt在正常膀胱黏膜組織陽性表達率均低于膀胱尿路上皮癌組織中，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同一標本中PI3K和p-Akt的表達不具有相關性（r=0.051，P=0.747）。 結(jié)論 PI3K、p-Akt在膀胱尿路上皮癌中高表達，兩者在膀胱尿路上皮癌中共同促其發(fā)展，但其在膀胱尿路上皮癌的預后和進展中的作用尚不明確。
目的檢測胰島素樣生長因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）蛋白及其mRNA在肥胖大鼠行Roux-en-Y胃旁路手術（RYGB）前后的表達水平變化，并探討IGF-Ⅰ表達和脂肪細胞增殖、凋亡的關系。 方法①選取SPF級SD雄性大鼠70只，隨機分為空白對照組（NC組）10只和高脂飲食組60只。高脂飲食組大鼠給予特定配方高脂飼料，NC組大鼠給予特定配方維持飼料，6周后測量高脂飲食組大鼠的體質(zhì)量，選擇體質(zhì)量增加在前20位的肥胖大鼠，隨機分為胃旁路術組（GB組）10只和假手術組（SO組）10只。GB組大鼠行RYGB，SO組大鼠行假手術，NC組大鼠不接受任何手術。GB組和SO組大鼠于術中、3組大鼠于處理后12周取腹股溝脂肪組織[代表皮下脂肪組織（subcutaneous adipose tissue，SAT）]和附睪脂肪組織[代表內(nèi)臟脂肪組織（visceral adipose tissue，VAT）]各0.5 g，行免疫印跡法和實時熒光定量PCR法分別檢測脂肪組織中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達。②轉(zhuǎn)染實驗。將SAT細胞分為空白對照組（BC組，未行轉(zhuǎn)染）、IGF-Ⅰ（+）組（即基因過表達組）、IGF-Ⅰ（+）空載體組、IGF-Ⅰ（-）組（即基因沉默組）及IGF-Ⅰ（-）空載體組，轉(zhuǎn)染相應載體，每組設3個復孔。轉(zhuǎn)染48 h后進行細胞增殖與凋亡實驗，并采用免疫印跡法檢測蛋白激酶B（AKT）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的表達水平。③Wortmannin實驗。將SAT細胞分為Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組、Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）、Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）及Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）組，轉(zhuǎn)染相應載體類型24 h后，加入0.1 mmol/L Wortmannin，24 h后采用免疫印跡法檢測AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表達水平。 結(jié)果①PCR結(jié)果表明，在SAT組織中，同GB術前組比較，GB術后組的IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達水平均降低（P < 0.01），而SO術前組和SO術后組的IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；VAT中，5組大鼠的IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。②四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法結(jié)果表明，同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的增殖能力升高（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）組的細胞增殖緩慢（P=0.04）；流式細胞儀檢測結(jié)果表明，同對應的空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的細胞凋亡率較低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）組的細胞凋亡率較高（P=0.04）。③與IGF-Ⅰ（+）空載體組比較，IGF-Ⅰ（+）組的p-PI3K/PI3K（P=0.03）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均升高；與IGF-Ⅰ（-）空載體組相比，IGF-Ⅰ（-）組的p-PI3K/PI3K（P=0.04）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均降低。與Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）組比較，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）組的p-AKT/AKT比值較高（P < 0.05）；與Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）組比較，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）組的p-AKT/AKT比值較低（P < 0.05）。 結(jié)論IGF-Ⅰ參與大鼠皮下脂肪富集，RYGB能明顯降低大鼠皮下脂肪中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表達水平，從而達到減重效果。
目的 探究微RNA-27a（microRNA-27a，miR-27a）調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的人肺腺癌細胞株A549凋亡的影響，并初步探討其機制。方法 Starbase分析miR-27a與磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit delta，PIK3CD）存在互補的結(jié)合位點，并以雙熒光素酶驗證。將A549細胞分為正常組、LPS組、LPS+miR-27a模擬物陰性對照組、LPS+miR-27a模擬物組、LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組。LPS+miR-27a模擬物陰性對照組、LPS+miR-27a模擬物組、LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組分別轉(zhuǎn)染miR-27a模擬物陰性對照、LPS+miR-27a模擬物、LPS+miR-27a模擬物，培養(yǎng)細胞6 h，更換為完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h，然后除正常組外，其余各組細胞添加10 mg/L LPS刺激24 h，且LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組加入PI3K激活劑740 Y-P，正常組細胞完全培養(yǎng)液正常培養(yǎng)相同時間。實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測細胞中miR-27a表達水平；細胞計數(shù)試劑盒8檢測細胞增殖情況；Hoechst33342染色與流式細胞術檢測細胞凋亡情況；透射電鏡觀察A549細胞自噬；蛋白免疫印跡檢測細胞中PIK3CD、磷酸化AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）、微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 II，LC3Ⅱ）蛋白表達。結(jié)果 miR-27a與PIK3CD存在結(jié)合位點，并經(jīng)雙熒光素酶驗證。與正常組相比，LPS組、LPS+miR-27a模擬物陰性對照組A549細胞中miR-27a表達水平、增殖率、Bcl-2蛋白表達水平降低（P<0.05），凋亡率、細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平升高（P<0.05）；分別與LPS組、LPS+miR-27a模擬物陰性對照組相比，LPS+miR-27a模擬物組A549細胞中miR-27a表達水平、增殖率、細胞中Bcl-2蛋白表達水平升高（P<0.05），凋亡率、細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平降低（P<0.05）；與LPS+miR-27a模擬物組相比，LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組細胞中miR-27a表達水平、增殖率降低（P<0.05），凋亡率、細胞中PIK3CD、p-AKT、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平升高（P<0.05）。正常組細胞數(shù)量較多，細胞間排列緊密，可見核大小均一，細胞器結(jié)構(gòu)正常；LPS組和LPS+miR-27a模擬物陰性對照組可見細胞變圓，細胞核固縮，形成團塊現(xiàn)象，顯現(xiàn)多個大小不一的圓形自噬泡；LPS+miR-27a模擬物組核固縮細胞數(shù)降低，LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組核固縮細胞數(shù)較LPS+miR-27a模擬物組升高，均可見少量圓形自噬泡，但數(shù)目不一。結(jié)論 高表達miR-27a可以抑制PI3K/AKT通路，從而減輕LPS誘導的人肺腺癌細胞A549凋亡，而這一途徑可能與自噬減少相關。