摘要： 目的 探討溴代呋喃酮對胸心外科聚氯乙烯(PVC)材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影響，為生物材料表面改性研究及臨床生物材料植入感染的防治提供新思路。 方法 選用化學(xué)結(jié)構(gòu)具有代表性的三種溴代呋喃酮分為3組，呋喃酮1組：3,4-二溴基-5-羥基呋喃酮；呋喃酮2組：4-溴-5-(4-甲氧基苯基)-3-(甲氨基) 呋喃酮；呋喃酮3組：3,4-二溴基-5,5-二甲苯基2(5H)呋喃酮；對照組：PVC材料用酒精浸泡5 min；分別對4組PVC材料進行表面涂層改性，將改性過的PVC材料與表皮葡萄球菌共同培育；分別于培養(yǎng)6 h、12 h、18 h和24 h時用激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察PVC材料表面細菌群落及細菌生物膜厚度的形成，掃描電子顯微鏡觀察PVC材料表面細菌生物膜表面結(jié)構(gòu)。 結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡觀測結(jié)果顯示：呋喃酮2組各時間點PVC材料表面表皮葡萄球菌群落數(shù)量和細菌生物膜厚度明顯小于對照組(Plt;0.05)，呋喃酮1組、呋喃酮3組表皮葡萄球菌群落數(shù)量和細菌生物膜厚度與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Pgt;0.05)。掃描電子顯微鏡觀察顯示: 與對照組比較，呋喃酮2組6 h時PVC材料表面細菌群落附著數(shù)量較少；18 h時對照組PVC材料表面細菌生物膜結(jié)構(gòu)初步形成，而呋喃酮2組無明顯細菌生物膜結(jié)構(gòu)形成。 結(jié)論 不同溴代呋喃酮對PVC材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成的影響不同，呋喃酮2可以抑制PVC材料表面表皮葡萄球菌群落數(shù)量和細菌生物膜厚度的形成。
目的 表皮葡萄球菌胞間黏附素基因（intercellar adhesion，ica）是細菌聚集的關(guān)鍵因子，通過分析醫(yī)源性表皮葡萄球菌生物膜基因型，探討ica 操縱子在聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材料表面細菌生物膜形成中的作用。 方法 取56 株醫(yī)源性表皮葡萄球菌臨床分離株，應(yīng)用PCR 法、基因測序技術(shù)檢測細菌生物膜形成相關(guān)基因，包括16S rRNA、自溶素（autolysin，atlE）、纖維蛋白原結(jié)合蛋白（fibrinogen binding protein，fbe）以及ica。取醫(yī)源性表皮葡萄球菌制備濃度為1 × 105 cfu/mL 的細菌懸液，并根據(jù)目的基因檢測結(jié)果，分別以icaADB、atlE、fbe 陽性基因型（ica 操縱子陽性組）以及icaADB 陰性而atlE、fbe 陽性基因型（ica 操縱子陰性組）與PVC 材料培養(yǎng)。于6、12、18、24、30 h 各取2 個PVC 材料，進行激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察，測量單位視野細菌群落數(shù)量及形成的細菌生物膜厚度。 結(jié) 果 目 的 基因檢測示，醫(yī)源性表皮葡萄球菌16S rRNA 陽性率為100%（56/56）；icaADB、atlE、fbe 陽性基因型菌株占57.1%（32/56）；icaADB 陰性而atlE、fbe 陽性基因型菌株占37.5%（21/56）。測序結(jié)果示，目的基因16S rRNA、atlE、fbe、icaADB 擴增產(chǎn)物序列分別與GenBank 中基因序列相符。隨時間延長，ica 操縱子陰性組的PVC 材料表面無明顯細菌生物膜形成；ica 操縱子陽性組的PVC 材料表面細菌群落數(shù)量逐漸增多，細菌生物膜體積逐漸增大，24 h 時可見成熟的細菌生物膜結(jié)構(gòu)，30 h 時細菌生物膜體積趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)各時間點ica 操縱子陽性組PVC 材料表面單位視野細菌群落數(shù)量（F=435.987，P=0.000）及細菌生物膜厚度（F=6 714.395，P=0.000）明顯高于ica 操縱子陰性組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 醫(yī)源性表皮葡萄球菌可以分為ica 操縱子陰性和ica 操縱子陽性兩類細菌；ica 操縱子可以增加PVC 材料表面細菌生物膜的形成能力、細菌群落數(shù)量及細菌生物膜厚度，在PVC 材料表面細菌生物膜形成中具有重要作用。
目的探討乳腺外科表皮葡萄球菌icaA、icaD和聚集相關(guān)蛋白（accumulation-associated protein，aap）基因?qū)毦锬ば纬傻挠绊憽? 方法于2011年12月－2013年1月乳腺外科收治的無感染癥狀女性患者臨床標(biāo)本中分離獲得44株表皮葡萄球菌。PCR檢測菌株icaA、icaD、aap基因，并根據(jù)基因表達結(jié)果將其分為icaA+icaD+/aap+組（A組）、icaA+icaD+/aap-組（B組）、icaA-icaD-/aap+組（C組）及icaA-icaD-/aap-組（D組）。取4組菌株制備硅膠材料表面細菌生物膜體外模型，于孵育8、12、24、30、36 h采用結(jié)晶紫染色法半定量檢測細菌黏附能力，孵育12、24 h激光共聚焦顯微鏡觀測形成的生物膜厚度，孵育24 h掃描電鏡觀察細菌生物膜超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果PCR檢測結(jié)果示，44株表皮葡萄球菌中，13株為icaA+icaD+/aap+（A組），12株為icaA+icaD+/aap-（B組），16株為icaA-icaD-/aap+（C組），3株為icaA-icaD-/aap-（D組）。共29株（65.9%）形成細菌生物膜，其中A組13株，B組7株，C組9株，D組0株。半定量黏附實驗示：孵育8 h，4組細菌黏附能力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；12～36 h時，A、B、C組黏附能力均顯著高于D組，A組顯著高于B、C組（P＜0.05），B、C組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。激光共聚焦顯微鏡觀察示，12、24 h時A、B、C組細菌生物膜厚度均大于D組，A組明顯大于B、C組（P＜0.05）；B、C組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。掃描電鏡觀察示，孵育24 h時A、B、C組硅膠片表面均可見成熟的細菌生物膜結(jié)構(gòu)，其中A組細菌生物膜分布最廣泛、結(jié)構(gòu)最致密、層次最豐富，B、C組細菌生物膜結(jié)構(gòu)相似；D組無明顯細菌生物膜形成。 結(jié)論icaA、icaD基因及aap基因?qū)Ρ砥て咸亚蚓诠枘z表面的細菌生物膜形成均起重要作用，其中aap基因與icaA、icaD基因同時表達的菌株具有最強的細菌生物膜形成能力。
目的探討表皮葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因——胞間黏附素A（intercellular adhesion A,icaA）基因、纖維蛋白原結(jié)合蛋白（fibrinogen binding protein,fbe）基因、聚集相關(guān)蛋白（accumulation-associated protein,aap）基因在表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生物膜形成中的作用。 方法實驗分為3組，用表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35984（表葡組）及白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC10231（白念組）分別培養(yǎng)及混合培養(yǎng)（混合組），建立表皮葡萄球菌、白假絲酵母菌及二者混合生長的體外生物膜模型。于培養(yǎng)2、4、6、8、12、24、48、72 h，采用結(jié)晶紫染色法半定量檢測生物膜形成能力，二甲氧唑黃[（2，3 bis （2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）5〔（phenylamino）Carbonyl〕2H-tetrazolium hydroxide assay，XTT]比色法評價生物膜體外生長動力學(xué)；24、72 h掃描電鏡觀察生物膜超微結(jié)構(gòu)。熒光定量PCR分析培養(yǎng)72 h表葡組及混合組icaA、fbe、aap基因表達情況。 結(jié)果結(jié)晶紫染色法生物膜半定量檢測示，混合組和表葡組均在培養(yǎng)12 h生物膜明顯增厚，72 h混合組超過表葡組，組間比較除72 h外，其余各時間點兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；白念組12 h出現(xiàn)生物膜的生長，在整個培養(yǎng)周期白念組生物膜厚度均低于混合組（P＜0.05）。XTT比色法生長動力學(xué)檢測示，混合組整體生長速度快于白念組，且48 h后超過表葡組；混合組與表葡組除12 h差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）外，其余各時間點比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；混合組培養(yǎng)2、4 h時A值低于白念組，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；6 h后各時間點A值均顯著高于白念組（P＜0.05）。掃描電鏡觀察示，隨培養(yǎng)時間延長各組均形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成熟的生物膜。培養(yǎng)72 h熒光定量PCR檢測示，與表葡組相比，混合組fbe、icaA、aap基因表達量分別增高1.93、1.52、1.46倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論表皮葡萄球菌和白假絲酵母菌混合生長能形成比單一微生物結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的混合生物膜；混合生物膜較單一微生物生物膜更厚，可能與表皮葡萄球菌icaA、aap、fbe基因表達增加有關(guān)。
目的建立乳房假體細菌感染動物模型，觀察感染對假體周圍纖維包膜形成的影響，探討感染與纖維包膜攣縮的相關(guān)性。 方法選取健康成年雌性滇南小耳豬3頭，隨機分為A、B、C組（分別有12、10、12只乳頭）。乳房假體植入前，A、B、C組分別于分離的乳房后間隙腔穴內(nèi)注入無菌PBS液、SE ATCC12228細菌懸液（1.2×105 CFU/mL）和SE RP62A細菌懸液（1.2×105 CFU/mL）各1 mL；之后每只乳房腔穴內(nèi)植入10 mL無菌硅凝膠假體1枚，3組共植入假體34枚。實驗動物術(shù)后于清潔環(huán)境中飼養(yǎng)13周后取假體周圍包膜，用壓平式眼壓計檢測包膜張力，電子天平稱量包膜重量；取包膜標(biāo)本行HE染色觀察包膜結(jié)構(gòu)特點并測量包膜厚度，Van-Gieson苦味酸酸性復(fù)紅染色（VG染色）觀察包膜膠原特點，α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫組織化學(xué)染色觀察包膜肌成纖維細胞。 結(jié)果術(shù)后切口均愈合，實驗動物生命體征平穩(wěn)。13周后3組假體周圍均形成完整纖維包膜，3組間包膜張力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；C組包膜重量明顯大于A、B組（P＜0.05），A、B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。HE染色示，3組包膜均可見致密層和疏松層，C組包膜致密層和全層厚度均大于A、B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；A、B組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。VG染色示，C組包膜膠原纖維明顯較A、B組致密。α-SMA免疫組織化學(xué)染色示，C組包膜的α-SMA陽性表達細胞明顯多于A、B組。 結(jié)論乳房假體植入后感染對纖維包膜的形成有明顯影響，且與包膜攣縮發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。
目的建立聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材料表面白色念珠菌-表皮葡萄球菌混合生物膜體外模型，觀察混合生物膜的形成與微觀結(jié)構(gòu)。 方法取表皮葡萄球菌（ATCC35984）與白色念珠菌（ATCC10231），分別制備濃度為1×106 CFU/mL的懸液并混合后，與直徑0.5 cm PVC膜在胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth,TSB）培養(yǎng)基中共培養(yǎng)形成混合生物膜（實驗組）。培養(yǎng)2、6、12、24、48、72 h時取PVC膜，激光共聚焦顯微鏡檢測生物膜厚度、單位視野菌落數(shù)，并于48 h時測量生物膜內(nèi)活菌百分比、三維重建PVC膜表面生物膜圖像；掃描電鏡觀察各時間點混合生物膜結(jié)構(gòu)。以單純PVC膜置于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)作為對照組。 結(jié)果對照組各時間點PVC材料表面無病原菌黏附。實驗組激光共聚焦顯微鏡觀察示，培養(yǎng)6 h時可見菌落及生物膜形成，隨時間延長均逐漸增加，24 h時菌落達高峰，48 h時生物膜厚度達峰值。實驗組PVC膜表面菌落數(shù)比較，2、6、24 h間以及2、6 h與48、72 h間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），24、48、72 h間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；生物膜厚度除48、72 h間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義外（P＞0.05），其余各時間點間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。培養(yǎng)48 h時，混合生物膜外層活菌百分比明顯高于內(nèi)層及中間層（P＜0.05）。三維重建顯示混合生物膜表面凹凸不平，突起部分活菌數(shù)量較多。掃描電鏡觀察示，實驗組隨培養(yǎng)時間增加，PVC膜表面白色念珠菌由孢子狀逐漸伸長出現(xiàn)假絲狀及菌絲狀，表皮葡萄球菌黏附于白色念珠菌周圍，逐漸形成復(fù)雜的多層次網(wǎng)狀混合生物膜。 結(jié)論白色念珠菌-葡萄球菌混合培養(yǎng)可在PVC材料表面形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的混合生物膜，激光共聚焦顯微鏡、掃描電鏡與三維圖像重建技術(shù)的結(jié)合是研究混合生物膜的理想方法。
目的探討雌二醇對乳腺癌術(shù)后假體表面表皮葡萄球菌生長以及生物膜形成能力及其結(jié)構(gòu)的影響。 方法取表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC35984，調(diào)整濃度至1×107 CFU/mL或1×108 CFU/mL，與硅膠片和終濃度為125 pmol/L的雌二醇混合培養(yǎng)，制備硅膠材料表面細菌生物膜體外模型。于培養(yǎng)后4、6、12、24、48、72 h，采用結(jié)晶紫染色半定量檢測硅膠材料表面細菌生物膜形成能力，XTT法檢測硅膠材料表面細菌生長動力；根據(jù)以上檢測結(jié)果，選擇細菌懸液實驗濃度。取實驗濃度表皮葡萄球菌ATCC35984懸液以及終濃度為50、125、250、500 pmol/L的雌二醇懸液，分別與硅膠片混合培養(yǎng)制備生物膜體外模型，以未添加雌二醇懸液（0 pmol/L）作為對照；另取實驗濃度表皮葡萄球菌ATCC12228懸液，同法制備模型，作為陰性對照。于培養(yǎng)后4、6、12、24、48、72 h同上法檢測硅膠材料表面細菌生長動力及生物膜形成能力，掃描電鏡觀察硅膠材料表面細菌生物膜超微結(jié)構(gòu)；培養(yǎng)6、12、24 h激光共聚焦顯微鏡觀察硅膠材料表面細菌生物膜厚度。 結(jié)果根據(jù)XTT法及結(jié)晶紫染色半定量檢測結(jié)果，選擇濃度為1×107 CFU/mL細菌懸液進行實驗。XTT法檢測示，ATCC12228和ATCC35984菌株分別在4、6、12、24、72 h和4、6、24、72 h時，其125、250、500 pmol/L組細菌生長速度快于0、50 pmol/L組（P < 0.05），4、6、72 h時500 pmol/L組快于125、250 pmol/L組（P < 0.05），72 h時250 pmol/L組快于125 pmol/L組（P < 0.05），其余組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；同一時間點兩種菌株相同雌二醇濃度組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)晶紫染色半定量檢測：各時間點ATCC12228菌株各雌二醇濃度組生物膜形成均為陰性。而ATCC35984菌株培養(yǎng)4 h即有生物膜形成，隨時間延長逐漸增厚，24 h時達峰值；培養(yǎng)4、6 h，0 pmol/L組生物膜厚度大于125、250、500 pmol/L組（P < 0.05）；12 h開始125 pmol/L組生物膜最厚，與其他組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。激光共聚焦顯微鏡觀察示，ATCC35984菌株在培養(yǎng)6 h時125、250、500 pmol/L組的生物膜厚度小于0、50 pmol/L組（P < 0.05），其余組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；之后各組生物膜厚度逐漸增加，12、24 h時125 pmol/L組生物膜厚度明顯大于其他濃度組（P < 0.05）。掃描電鏡觀察示，各時間點與其他濃度組相比，125 pmol/L組形成的生物膜結(jié)構(gòu)范圍最廣，結(jié)構(gòu)最致密、最豐富、層次最多。 結(jié)論高濃度雌二醇可促進表皮葡萄球菌生長、生物膜形成和生物膜的成熟。
目的探討表皮葡萄球菌附屬基因調(diào)節(jié)子 C（accessory gene regulator C，agr C）特異結(jié)合多肽（簡稱為 N1）對聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材料表面表皮葡萄球菌生物膜形成作用的體外研究。方法以表皮葡萄球菌 ATCC35984（生物膜表型陽性）和 ATCC12228（生物膜表型陰性）作為研究對象。首先將兩菌株分別加入濃度為 100、200、400、800、1 600 μg/mL 的 N1 培養(yǎng)，以相同濃度 agrC 特異結(jié)合無關(guān)肽（簡稱為 N0）培養(yǎng)作為對照；24 h 后測定吸光度（A）值，確定 N1 最佳抑菌濃度。兩菌株與最佳抑菌濃度的 N1 及 N0 分別培養(yǎng)，6、12、18、24、30、48 h 測定 A 值，觀察 N1 對表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響；在此基礎(chǔ)上與 PVC 材料片培養(yǎng) 6、12、18、24、30 h，掃描電鏡觀察 PVC 材料表面生物膜的表面結(jié)構(gòu)；另取與 ATCC35984 菌株培養(yǎng) 6、12、18、24 h 的 PVC 材料片，激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜厚度。結(jié)果A 值測定顯示，N1 對 ATCC35984 菌株最佳抑菌濃度為 800 μg/mL。ATCC12228 菌株與 N1 及 N0 培養(yǎng)后均未形成明顯生物膜；ATCC35984 菌株與 N1 及 N0 培養(yǎng) 12 h 時，生物膜形成能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），6、18、24、30、48 h 時差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。掃描電鏡觀察，ATCC35984 菌株與 N1 及 N0 培養(yǎng)后，隨時間延長均見成熟生物膜結(jié)構(gòu)；而 ATCC12228 菌株培養(yǎng)后均未見生物膜形成。激光共聚焦顯微鏡觀察，ATCC35984 菌株與 N1 培養(yǎng) 12 h 時細菌量明顯少于與 N0 培養(yǎng)，且以死細菌居多；6、18、24 h 時兩種培養(yǎng)條件下細菌數(shù)量未見明顯差別，均以活細菌居多；同時，N1 培養(yǎng) 12、18 h 時生物膜厚度明顯小于 N0 培養(yǎng)（P<0.05）。結(jié)論N1 抑制表皮葡萄球菌生物膜形成的強度有量效關(guān)系；其在聚集期阻礙細菌的增殖和聚集，抑制生物膜形成，對成熟生物膜抑制作用不明顯。
目的探討表皮葡萄球菌胞間黏附素基因（intercellular adhesion，ica）操縱子對氣管導(dǎo)管材料表面表皮葡萄球菌與白假絲酵母菌混合生物膜相關(guān)炎癥作用影響的體內(nèi)研究。方法取表皮葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株 RP62A（ica 操縱子陽性，陽性組）、ATCC12228（ica 操縱子陰性，陰性組）制備濃度為 1×106CFU/mL 的菌液，分別與相同濃度的白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)株 ATCC10231 菌液按照 1∶1 比例制備成混合培養(yǎng)菌液后，與氣管導(dǎo)管材料片孵育 24 h，掃描電鏡觀察材料表面混合生物膜形成情況。取 4～6 月齡新西蘭兔 30 只分為兩組（n=15），分別于氣管旁植入孵育 24 h 的陽性組及陰性組氣管導(dǎo)管材料。于術(shù)前及術(shù)后 1、3、7 d 測量兩組兔體質(zhì)量。術(shù)后 1、3、7 d，采用 ELISA 檢測試劑盒檢測血漿中 IL-1β、IL-6、TNF-α 和單核細胞趨化蛋白 1（monocytechemotactic protein 1，MCP-1）水平；術(shù)后 7 d，掃描電鏡觀察取出的氣管導(dǎo)管材料片表面混合生物膜形成情況，HE 染色觀察材料周圍組織炎癥浸潤情況，平板菌落計數(shù)法觀察心臟、肺、肝臟、腎臟細菌感染情況。結(jié)果掃描電鏡觀察示體外孵育 24 h 后陽性組可見明顯混合生物膜結(jié)構(gòu)，陰性組未見混合生物膜形成。體內(nèi)實驗顯示兩組術(shù)前及術(shù)后 1、3、7 d 體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與陰性組相比，陽性組術(shù)后 1 d IL-1β 及 MCP-1 水平，術(shù)后 3、7 d IL-1β、MCP-1、IL-6、TNF-α 水平均升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。掃描電鏡觀察示陽性組可見大量表皮葡萄球菌殘留以及混合生物膜結(jié)構(gòu)，陰性組見極少量表皮葡萄球菌殘留，未見混合生物膜結(jié)構(gòu)。HE 染色示兩組材料周圍組織均可見炎癥細胞浸潤，其中陽性組中性粒細胞及淋巴細胞浸潤較陰性組嚴(yán)重。兩組心臟、肝臟細菌感染數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），陽性組肺、腎臟細菌感染數(shù)量高于陰性組（P<0.05）。結(jié)論ica 操縱子在表皮葡萄球菌與白假絲酵母菌混合感染中可能由于增強了混合生物膜結(jié)構(gòu)及其在體內(nèi)的傳播，導(dǎo)致炎癥因子升高，細菌難以清除，感染遷延不愈。