目的 通過研究大鼠股骨干骨折合并腦外傷時骨痂組織內骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP2）表達水平的變化，探討腦外傷對骨折愈合的影響及作用機制。 方法 取12周雄性SD大鼠32只，體重368±25 g。隨機分成4組，每組8只：A組為骨折合并腦外傷1周組，B組為單純骨折1周組，C組為骨折合并腦外傷2周組，D組為單純骨折2周組。A、C組制作腦外傷和股骨干骨折模型，B、D組制作單純股骨干骨折模型作對照。各組攝X線片后截取骨痂，行HE染色觀察骨痂生長情況及其組織形態(tài)，免疫組織化學染色測定BMP-2表達，RT-PCR檢測BMP-2 mRNA水平。結果 X線片示A組骨折端有較少量骨痂形成，骨折線較清晰；B組骨折線清晰；C組骨折端有較多骨痂形成，骨折線已模糊；D組僅有少量骨痂形成，骨折線較清晰。HE染色A組可見較多早期軟骨細胞、成纖維細胞；B組骨折間隙可見成纖維細胞，僅夾雜有少量的早期軟骨細胞；C組骨折端有新生骨小梁長入；D組未見有骨小梁形成。免疫組織化學染色可見成纖維細胞、間充質細胞、血管內皮細胞、早期軟骨細胞、成骨細胞胞漿均出現(xiàn)廣泛的強陽性反應，A組陽性細胞數(shù)量多于B組，并且顯色強；C組陽性細胞數(shù)量多于D組，并且顯色強。分析顯示A、C組平均陽性細胞百分數(shù)為0.762%±0.052%、0.756%±0.079%，分別高于同一時間點B、D組的0.702%±0.052%、0.672%±0.044%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。RT- PCR分析顯示：A～D組骨痂BMP-2 mRNA 含量依次遞減，A、C組骨痂BMP-2 mRNA 含量為1.07±0.13、0.78±0.11，均顯著高于同一時間點B、D組的0.91±0.12、0.61±0.08，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結論 腦外傷對骨折愈合有促進作用，可能與腦外傷后BMP2表達水平升高有關。
目的 探討自行合成的骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)活性多肽對大鼠骨髓間充質干細胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）體外定向誘導成骨的能力，評價BMP-2活性多肽的成骨誘導性及誘導成骨的劑量依賴性 方法取4周齡Wistar大鼠分離培養(yǎng)MSCs，傳至第3代時改用條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分別加入濃度為300、200、100、50及0 μg/ml的BMP2活性多肽，并依次記為A、B、C、D和E組。細胞培養(yǎng)至5、10、15及20 d，檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性，測定鈣含量，采用實時熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)QPCR)檢測Ⅰ型膠原、骨橋蛋白 (osteopontin，OPN) 及骨鈣素（osteocalcin，OCN） mRNA的表達，檢測不同濃度BMP2活性多肽體外誘導成骨的能力。結果 倒置相差顯微鏡下觀察，用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3～4 d后，培養(yǎng)細胞由長梭形轉變?yōu)槎趟笮位蚨嘟切?。隨條件培養(yǎng)基中BMP-2活性多肽濃度的增加，細胞發(fā)生成骨樣改變的時間提前。ALP活性和鈣含量檢測顯示，A組和B組較其他組增加明顯，且差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但A、B組間比較差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。FQ-PCR檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度條件培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后，Ⅰ型膠原、OPN和OCN mRNA在各組均有表達。Ct值表明其表達量的大小順序為A、B、C、D組，E組無表達，A組和B組的Ct值明顯大于C組和D組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），但A組和B組之間差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。結論 BMP-2活性多肽能有效地促進MSCs向成骨方向分化，其誘導作用存在劑量依賴關系，最佳誘導劑量為200 μg/ml。
目的 檢測重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）與納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸（nano-hydroxyapatite/collagen/ polylactic acid, nHAC/PLA）復合后形成的活性nHAC/PLA（active nHAC/ PLA, AnHAC/PLA）修復顱骨極限缺損的效果。方法 新西蘭大白兔48只，體重2.0~2.5 kg。制備直徑為15 mm的顱骨全層缺損模型，隨機分成4組，每組12只。陽性對照組：缺損區(qū)植入自體髂骨；空白對照組：缺損區(qū)不植入任何材料；陰性對照組：缺損區(qū)植入nHAC/PLA；實驗組：缺損區(qū)植入AnHAC/PLA，每塊AnHAC/PLA上平均吸附rhBMP-21.431 mg。術后8、16周通過比較顱骨缺損區(qū)X線阻射面積占總缺損面積百分比、HE染色和Masson’s三色法染色觀察顱骨極限缺損的修復情況。結果；術后8、16周，各組顱骨缺損區(qū)X線阻射程度，陽性對照組分別為67.21%±2.06%、86.48%±1.73%，空白對照組分別為5.84%±1.92%、9.48%±2.72%，陰性對照組分別為19.13%±2.51%、3567%±3.28%，實驗組分別為58.84%±2.55%、85.61%±3.36%。其中除16周實驗組與陽性對照組以及空白對照組8、16周比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)外，其余各組各時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。組織學觀察顯示,陽性對照組骨缺損區(qū)16周骨小梁較8周增寬，被大量骨組織充填；空白對照組8、16周骨缺損區(qū)均被纖維組織充填，無新骨生成；陰性對照16周骨缺損區(qū)為剩余材料與纖維組織充填，周邊新骨較8周形成增多；實驗組8周材料植入?yún)^(qū)為新生骨替代，16周新生骨呈板層狀，缺損區(qū)材料殘留較少，且周圍可見較多成骨細胞。結論 nHAC/PLA是rhBMP-2的良好載體，兩者復合后制備的AnHAC/PLA具有良好骨形成能力，有望應用于臨床上修復較大型骨缺損。
目的 觀察重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2）與骨誘導劑對SD大鼠骨髓間充質干細胞 (mesenchymalstem cells, MSCs)的增殖與成骨作用。 方法 體外培養(yǎng)大鼠MSCs，分為實驗組與對照組。對照組：不加rhBMP-2與骨誘導劑。實驗組：骨誘導劑單獨作用于SD大鼠MSCs（A組）；rhBMP-2分別以濃度為10（B組）、50 (C組)、100 (D組)、200 μg/L (E組)單獨作用于SD大鼠MSCs；rhBMP-2分別以濃度為10 (F組)、50 (G組)、100 (H組)、200 μg/L(I組)聯(lián)合骨誘導劑作用于SD大鼠MSCs。測定第3、6、9、12天的增殖狀況（MTT法）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和骨鈣素（osteocalcin,OC）水平。 結果 倒置相差顯微鏡觀察SD大鼠MSCs原代培養(yǎng)時，細胞接種12 h后即可貼壁；48 h細胞成梭形，形似成纖維細胞；4 d時細胞為多角形、紡錘形；6 d時，成纖維細胞散在分布，少量呈集落樣生長，為漩渦狀、放射狀排列；10 d左右，細胞基本鋪滿瓶底，融合成片。傳代細胞5～7 d即可長滿瓶底。各時間點A~I組均能顯著促進MSCs成骨活性（ALP和OC）的表達。B~E組同時具有促進MSCs 增殖作用，并呈濃度依賴性；F~I組增殖及ALP、OC含量均高于A~E組，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 結論 rhBMP-2與骨誘導劑聯(lián)合作用可在促進MSCs增殖的同時提高其成骨活性。
目的 觀察年齡因素對骨髓間充質干細胞（marrow mesenchymal stem cells, MSCs）成骨分化能力的影響；了解基因治療對老年大鼠MSCs成骨分化能力的影響。 方法 1月齡（幼年組）、9月齡（成年組）及24月齡（老年組）雄性Wistar大鼠各6只，取MSCs經體外分離、培養(yǎng)及攜帶骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）基因的腺病毒載體（Ad-BMP-2）轉染后，定量檢測BMP-2、堿性磷酸酶（alkaline phosphate，ALP）表達，以及成骨細胞標志性蛋白：Ⅰ型膠原、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和骨橋素（osteopontin, OPN）的表達。將轉染的各組MSCs分別與磷酸三鈣（tricalcium phosphate, TCP）復合后植入裸鼠體內，3周后取材，比較各組誘導異位成骨能力。 結果 ELISA檢測表明BMP-2基因修飾的MSCs可以有效表達BMP-2,且表達量在各年齡組間差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；各組ALP于誘導后第9天達高峰，但組間差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；誘導后第7天，RT-PCR半定量檢測示各組均有成骨細胞特征性蛋白，即：Ⅰ型膠原、OPN及BSP的明顯表達，表達量在各組間差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；BMP2基因轉染的MSCs與TCP復合后可誘導裸鼠體內異位成骨，各組成骨量差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。 結論 BMP-2基因修飾的老年大鼠MSCs可以恢復成骨分化能力，基因治療可能為老年性骨骼疾病提供一種新的治療途徑。
目的 探討構建人骨形成蛋白2（human bone morphgenetic protein 2，hBMP-2）真核表達載體的方法。 方法 由人成骨肉瘤細胞中提取細胞總RNA，利用RT-PCR方法擴增獲得hBMP-2基因cDNA，將基因片斷重組到pGEM-T質粒中構建pGEMT- hBMP-2重組質粒載體，轉化到大腸桿菌DH5α后篩選陽性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鑒定重組質粒。分別用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切pGEM-T- hBMP-2 質粒和pcDNA3.1(+)真核表達載體，將克隆載體中hBMP基因重組到pcDNA3.1(+)真核表達載體 ，提取質粒作酶切電泳、PCR鑒定及DNA測序。 結果 人骨肉瘤細胞中經RT-PCR得到1.2 kbp的hBMP-2擴增條帶，重組質粒pGEM-T-hBMP-2經酶切電泳可見1.2 kbp的hBMP-2條帶和4.0 kbp的載體片斷；pcDNA3.1-hBMP-2 質粒經酶切電泳可見1.2 kbp的hBMP2條帶和5.0 kbp的載體片斷，重組質粒酶譜分析與預期一致；DNA序列分析測序結果校對后經BLAST分析，表明核酸序列與Gene Bank中和hBMP-2 的mRNA序列完全吻合。 結論 通過此方法能成功克隆獲得hBMP-2基因，并構建其真核表達載體。
目的 觀察直接壓縮沖擊對骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2,BMP-2）基因修飾的組織工程骨細胞存活和成骨的影響，以探討組織工程骨壓縮植骨的可行性。 方法 體外培養(yǎng)擴增犬骨髓基質干細胞（marrow stromal stem cells,MSCs）轉染腺病毒介導的人BMP-2（adenovirus mediated human BMP-2, Adv-hBMP-2）基因，與顆粒狀的犬異體凍干松質骨復合。復合后4 d進行模擬壓縮實驗，分別于復合后24 h、4 d，壓縮后即刻、1、4 d以掃描電鏡觀察細胞形態(tài)及數(shù)量。將單純凍干骨、未經壓縮的Adv-hBMP-2基因修飾的組織工程骨和壓縮后4 d的Adv-hBMP-2基因修飾的組織工程骨植入裸鼠背部皮下，于術后6周行組織學觀察新骨形成及凍干骨吸收情況。 結果 復合24 h凍干骨表面細胞展開，部分孔隙可見單層細胞生長；4 d后凍干骨表面細胞復層生長，膠原量多；壓縮后即刻，凍干骨與沖擊器接觸的外表面基本無細胞存在，剖開面可見細胞片狀掀起，碎片多；壓縮后1 d，凍干骨表面細胞大部分脫落掀起，形成較多的細胞碎片；4 d后細胞數(shù)量明顯減少，膠原分泌量增多。植入裸鼠背部皮下后，單純凍干骨新骨形成極少，孔隙內主要為纖維組織，未經壓縮的Adv-hBMP-2基因的組織工程骨組可見大量新骨形成，材料中心與周圍新骨分布均勻，壓縮后的AdvhBMP2基因的組織工程骨組新骨量明顯減少，且主要在外周。 結論 體外模擬壓縮植骨可明顯減少基因修飾的組織工程骨中的細胞存活及體內成骨，但存活細胞的功能仍存在，可適用于壓縮植骨重建假體周圍骨缺損。
目的 研究人骨形成蛋白2腺病毒表達載體（adenovirusmediated human bone morphogenetic protein 2 gene，Ad-hBMP-2）轉染體外培養(yǎng)兔腰椎間盤細胞，分析其對腰椎間盤細胞的影響。方法 成年健康新西蘭大白兔4只，體重4~5 kg，取L 2、L3到L6、L7節(jié)段椎盤細胞體外培養(yǎng)。利用免疫熒光和蛋白印跡法(Western blot)檢測空白對照組(未轉染)、Ad-LacZ組［感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)150MOI］和不同劑量Ad-hBMP-2(50、100、150 MOI)組轉染后細胞hBMP-2的表達水平。采用RT-PCR檢測轉染后細胞Ⅱ型膠原和aggrecan mRNA表達水平。結果 轉染Ad-hBMP-2后通過免疫熒光和蛋白印跡法可見隨轉染劑量增加hBMP-2表達量逐漸增加,與50 MOI組比較100 MOI組升高102%，150 MOI組升高183%。在轉染后第6天RT-PCR結果顯示轉染組aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA的表達高于對照組，并且隨轉染劑量增高mRNA的表達量均逐漸增加。aggrecan mRNA從50 MOI組的61.7%增加到150 MOI組的167.3%。Ⅱ型膠原mRNA從50 MOI組的77.3%增加到150 MOI組的169.0%。結論Ad-hBMP-2可高效轉染體外培養(yǎng)兔腰椎間盤細胞，隨轉染劑量增加hBMP-2表達量逐漸增加，同時上調aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA的表達,并存在劑量依賴關系。
目的 研究轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2） 對雪旺細胞生物學行為的影響。方法 體外培養(yǎng)SD乳鼠雪旺細胞, 按5×103/孔接種96孔板，分為3組。A組：加入50 ng/ml TGF-β；B組：加入50 ng/ml rhBMP-2；C組不作任何處理，作為空白對照組。采用MTT法每天取4孔連測9 d細胞數(shù)，并繪制生長曲線；流式細胞儀測定細胞周期以觀察雪旺細胞增殖情況；ELISA雙夾心法測定培養(yǎng)液中神經生長因子（nerve growth factor，NGF）含量。結果 MTT法檢測顯示A、B組細胞生長曲線遠離C組,逐漸上升到第8、9天差異明顯，A組較B組上升趨勢更明顯,差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。流式細胞儀測定顯示A組和B組細胞增殖指數(shù)較C組高（Plt;0.05）。ELISA法檢測A組上清NGF含量最高，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）。結論 外源性TGF-β、rhBMP-2均能促進雪旺細胞增殖和分泌NGF的功能，而TGF-β更優(yōu)于rhBMP-2。
目的 研究多孔磷酸鈣人工骨（porous calcium phosphate cement, PCPC）與重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）復合后體外的緩釋作用及其對兔骨缺損的修復作用。方法 采用物理吸附法將rhBMP-2（0.4 mg）溶液吸附至PCPC中，制備成PCPC/rhBMP-2復合材料。凍干后，掃描電鏡觀察復合材料內部形態(tài)。以包覆殼聚糖的PCPC/rhBMP-2為實驗組，單純PCPC/rhBMP-2為對照組，測試在模擬體液中的rhBMP-2緩釋行為。取新西蘭大白兔12只，股骨遠端制成直徑4.2 mm，深5.0 mm的骨缺損模型。將包覆殼聚糖的PCPC/rhBMP-2復合材料修復骨缺損作為實驗組，以植入單純PCPC作為對照組。術后觀察動物一般情況，于4周和8周取材行X線片和組織學觀察。結果 掃描電鏡顯示PCPC/rhBMP-2復合材料孔隙中吸附了大量的rhBMP-2。 rhBMP-2體外緩釋：對照組rhBMP-2于150 h基本全部釋放；實驗組rhBMP-2于350 h緩釋量約達99％，較對照組慢。動物實驗：動物術后切口無感染，于4周行動自如。X線片示術后4周對照組骨缺損區(qū)材料清晰，實驗組骨缺損區(qū)密度大部分接近宿主骨，材料模糊；8周對照組材料邊緣較術后4周模糊，實驗組骨缺損區(qū)密度已基本接近宿主骨。組織學觀察，術后4周對照組可見少量成骨細胞和破骨細胞，實驗組可見成熟骨組織和骨髓腔，新生骨逐漸取代材料；8周對照組可見大量成骨細胞和破骨細胞，少量新生骨并向材料內長入，實驗組可見成熟骨小梁和骨髓組織。結論 PCPC是rhBMP-2較理想的載體材料，復合后具有良好的誘導成骨作用，可作為一種新型復合人工骨修復骨缺損，具有良好的臨床應用前景。