目的 檢測重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）與納米羥基磷灰石/膠原/聚乳酸（nano-hydroxyapatite/collagen/ polylactic acid, nHAC/PLA）復(fù)合后形成的活性nHAC/PLA（active nHAC/ PLA, AnHAC/PLA）修復(fù)顱骨極限缺損的效果。方法 新西蘭大白兔48只，體重2.0~2.5 kg。制備直徑為15 mm的顱骨全層缺損模型，隨機(jī)分成4組，每組12只。陽性對照組：缺損區(qū)植入自體髂骨；空白對照組：缺損區(qū)不植入任何材料；陰性對照組：缺損區(qū)植入nHAC/PLA；實(shí)驗(yàn)組：缺損區(qū)植入AnHAC/PLA，每塊AnHAC/PLA上平均吸附rhBMP-21.431 mg。術(shù)后8、16周通過比較顱骨缺損區(qū)X線阻射面積占總?cè)睋p面積百分比、HE染色和Masson’s三色法染色觀察顱骨極限缺損的修復(fù)情況。結(jié)果；術(shù)后8、16周，各組顱骨缺損區(qū)X線阻射程度，陽性對照組分別為67.21%±2.06%、86.48%±1.73%，空白對照組分別為5.84%±1.92%、9.48%±2.72%，陰性對照組分別為19.13%±2.51%、3567%±3.28%，實(shí)驗(yàn)組分別為58.84%±2.55%、85.61%±3.36%。其中除16周實(shí)驗(yàn)組與陽性對照組以及空白對照組8、16周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)外，其余各組各時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組織學(xué)觀察顯示,陽性對照組骨缺損區(qū)16周骨小梁較8周增寬，被大量骨組織充填；空白對照組8、16周骨缺損區(qū)均被纖維組織充填，無新骨生成；陰性對照16周骨缺損區(qū)為剩余材料與纖維組織充填，周邊新骨較8周形成增多；實(shí)驗(yàn)組8周材料植入?yún)^(qū)為新生骨替代，16周新生骨呈板層狀，缺損區(qū)材料殘留較少，且周圍可見較多成骨細(xì)胞。結(jié)論 nHAC/PLA是rhBMP-2的良好載體，兩者復(fù)合后制備的AnHAC/PLA具有良好骨形成能力，有望應(yīng)用于臨床上修復(fù)較大型骨缺損。
目的 在體外運(yùn)用人骨形成蛋白7(human bone morphogeneticprotein 7,hBMP7)基因重組35 型腺病毒(recombinant adenovirus’s containing fibers derived from Bgroup serotype 35，rAd5/F35) 誘導(dǎo)大鼠脂肪源性干細(xì)胞（adiposederived adult stem cell, ADASC）向成骨細(xì)胞定向分化，為骨組織工程探索新的細(xì)胞來源。 方法 以pcDNA1.1/氨芐青霉素-hBMP-7質(zhì)粒為模板擴(kuò)增hBMP-7基因，將回收的PCR產(chǎn)物片段克隆入pDC316載體，獲得重組質(zhì)粒pDC316-hBMP-7。骨架質(zhì)粒pBHG-fiber5/35和穿梭質(zhì)粒pDC316-hBMP-7共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，同源重組產(chǎn)生rAd5/F35-hBMP-7。同樣的方法構(gòu)建rAd5/F35增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)。在體外分別轉(zhuǎn)染大鼠ADASC并留置空白對照。觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況，ELISA檢測轉(zhuǎn)染基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，檢測鈣結(jié)節(jié)和骨鈣素等成骨細(xì)胞表型。 結(jié)果 PCR、酶切鑒定表明rAd5/F35－h(huán)BMP-7質(zhì)粒構(gòu)建正確。rAd5/F35-EGFP對大鼠ADASC中轉(zhuǎn)染效率可達(dá)90%以上，hBMP-7基因存在于轉(zhuǎn)染后的ADASC中并表達(dá)相應(yīng)的蛋白，誘導(dǎo)組鈣結(jié)節(jié)形成，電鏡見胞質(zhì)中有鈣質(zhì)成分，堿性磷酸酶陽性，骨鈣素表達(dá)增強(qiáng)。 結(jié)論 rAd5/F35介導(dǎo)hBMP-7基因可促進(jìn)ADASC向成骨細(xì)胞定向分化。
目的 觀察重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2）與骨誘導(dǎo)劑對SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymalstem cells, MSCs)的增殖與成骨作用。 方法 體外培養(yǎng)大鼠MSCs，分為實(shí)驗(yàn)組與對照組。對照組：不加rhBMP-2與骨誘導(dǎo)劑。實(shí)驗(yàn)組：骨誘導(dǎo)劑單獨(dú)作用于SD大鼠MSCs（A組）；rhBMP-2分別以濃度為10（B組）、50 (C組)、100 (D組)、200 μg/L (E組)單獨(dú)作用于SD大鼠MSCs；rhBMP-2分別以濃度為10 (F組)、50 (G組)、100 (H組)、200 μg/L(I組)聯(lián)合骨誘導(dǎo)劑作用于SD大鼠MSCs。測定第3、6、9、12天的增殖狀況（MTT法）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和骨鈣素（osteocalcin,OC）水平。 結(jié)果 倒置相差顯微鏡觀察SD大鼠MSCs原代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞接種12 h后即可貼壁；48 h細(xì)胞成梭形，形似成纖維細(xì)胞；4 d時(shí)細(xì)胞為多角形、紡錘形；6 d時(shí)，成纖維細(xì)胞散在分布，少量呈集落樣生長，為漩渦狀、放射狀排列；10 d左右，細(xì)胞基本鋪滿瓶底，融合成片。傳代細(xì)胞5～7 d即可長滿瓶底。各時(shí)間點(diǎn)A~I組均能顯著促進(jìn)MSCs成骨活性（ALP和OC）的表達(dá)。B~E組同時(shí)具有促進(jìn)MSCs 增殖作用，并呈濃度依賴性；F~I組增殖及ALP、OC含量均高于A~E組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)論 rhBMP-2與骨誘導(dǎo)劑聯(lián)合作用可在促進(jìn)MSCs增殖的同時(shí)提高其成骨活性。
目的〓〖HTSS〗構(gòu)建重組人骨形成蛋白4（human bone morphogenetic protein 4, hBMP-4）基因腺相關(guān)病毒載體。方法根據(jù)hBMP-4的基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引入EcoRⅠ位點(diǎn)，下游引入Sal Ⅰ位點(diǎn)，以EX-A0242-M01-hBMP-4為模板擴(kuò)增目的基因。將hBMP4基因克隆入pUC18載體中，獲得重組質(zhì)粒pUC18-hBMP-4。然后用EcoRⅠ與SalⅠ酶切pUC18-hBMP-4及質(zhì)粒pSNAV，回收酶切片段，T4 DNA連接酶16℃過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受肽細(xì)胞，篩選陽性克隆獲得pSNAV-hBMP-4，EcoRⅠ／SalⅡ雙酶切鑒定，并行全基因測序。轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，G418篩選培養(yǎng)，獲得抗藥克隆細(xì)胞株。HSV1rc/△UL2感染，包裝此細(xì)胞株并收獲病毒載體AAV-hBMP-4。行DNA點(diǎn)雜交法測定病毒滴度，SDS-PAGE分析判斷病毒純度。結(jié)果 PCR電泳及酶切鑒定表明，pSNAV-hBMP-4重組成功，基因測序顯示裝入pSNAV質(zhì)粒中的hBMP-4基因正確；AAV-hBMP-4病毒的大致滴度為1.5×10 12 μg/ml，分泌蛋白濃度為0.124 mg/ml，病毒載體純度在95%以上。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)獲得的病毒載體滴度高、感染性好，可以滿足骨組織工程的需要。
目的 研究轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）、重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2，rhBMP-2） 對雪旺細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法 體外培養(yǎng)SD乳鼠雪旺細(xì)胞, 按5×103/孔接種96孔板，分為3組。A組：加入50 ng/ml TGF-β；B組：加入50 ng/ml rhBMP-2；C組不作任何處理，作為空白對照組。采用MTT法每天取4孔連測9 d細(xì)胞數(shù)，并繪制生長曲線；流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期以觀察雪旺細(xì)胞增殖情況；ELISA雙夾心法測定培養(yǎng)液中神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）含量。結(jié)果 MTT法檢測顯示A、B組細(xì)胞生長曲線遠(yuǎn)離C組,逐漸上升到第8、9天差異明顯，A組較B組上升趨勢更明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。流式細(xì)胞儀測定顯示A組和B組細(xì)胞增殖指數(shù)較C組高（Plt;0.05）。ELISA法檢測A組上清NGF含量最高，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)論 外源性TGF-β、rhBMP-2均能促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖和分泌NGF的功能，而TGF-β更優(yōu)于rhBMP-2。
目的 研究多孔磷酸鈣人工骨（porous calcium phosphate cement, PCPC）與重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）復(fù)合后體外的緩釋作用及其對兔骨缺損的修復(fù)作用。方法 采用物理吸附法將rhBMP-2（0.4 mg）溶液吸附至PCPC中，制備成PCPC/rhBMP-2復(fù)合材料。凍干后，掃描電鏡觀察復(fù)合材料內(nèi)部形態(tài)。以包覆殼聚糖的PCPC/rhBMP-2為實(shí)驗(yàn)組，單純PCPC/rhBMP-2為對照組，測試在模擬體液中的rhBMP-2緩釋行為。取新西蘭大白兔12只，股骨遠(yuǎn)端制成直徑4.2 mm，深5.0 mm的骨缺損模型。將包覆殼聚糖的PCPC/rhBMP-2復(fù)合材料修復(fù)骨缺損作為實(shí)驗(yàn)組，以植入單純PCPC作為對照組。術(shù)后觀察動(dòng)物一般情況，于4周和8周取材行X線片和組織學(xué)觀察。結(jié)果 掃描電鏡顯示PCPC/rhBMP-2復(fù)合材料孔隙中吸附了大量的rhBMP-2。 rhBMP-2體外緩釋：對照組rhBMP-2于150 h基本全部釋放；實(shí)驗(yàn)組rhBMP-2于350 h緩釋量約達(dá)99％，較對照組慢。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：動(dòng)物術(shù)后切口無感染，于4周行動(dòng)自如。X線片示術(shù)后4周對照組骨缺損區(qū)材料清晰，實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)密度大部分接近宿主骨，材料模糊；8周對照組材料邊緣較術(shù)后4周模糊，實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)密度已基本接近宿主骨。組織學(xué)觀察，術(shù)后4周對照組可見少量成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組可見成熟骨組織和骨髓腔，新生骨逐漸取代材料；8周對照組可見大量成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，少量新生骨并向材料內(nèi)長入，實(shí)驗(yàn)組可見成熟骨小梁和骨髓組織。結(jié)論 PCPC是rhBMP-2較理想的載體材料，復(fù)合后具有良好的誘導(dǎo)成骨作用，可作為一種新型復(fù)合人工骨修復(fù)骨缺損，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
目的 通過組織工程技術(shù)方法，研究細(xì)胞材料復(fù)合體體內(nèi)骨再生的能力。方法 采用材料學(xué)自組裝技術(shù)的原理，以I型膠原蛋白為分子模板，引導(dǎo)鈣磷鹽在液相中的礦化，制備具有天然骨基質(zhì)層狀結(jié)構(gòu)的羥基磷灰石/膠原復(fù)合材料，并以熱致分相法制備羥基磷灰石/膠原聚乳酸［hydroxyapatite/collagen-poly(L-lactic acid),HAC-PLA］復(fù)合三維多孔框架，與重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2,rhBMP-2）誘導(dǎo)分化后的兔骨膜細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨，進(jìn)行體外電鏡及組織學(xué)觀察。將3月齡裸鼠18只，分為3組，每組6只。A組皮下注射經(jīng)rhBMP-2處理后的骨膜細(xì)胞懸液，B組植入未復(fù)合細(xì)胞的HAC-PLA,C組植入rhBMP-2處理后的細(xì)胞-材料復(fù)合體。術(shù)后8周取材行組織學(xué)觀察，C組與B組及A組進(jìn)行比較。結(jié)果 三維多孔HAC-PLA框架材料孔隙率大于90%，孔徑為50～300 μm。骨膜細(xì)胞經(jīng)500 ng/ml的rhBMP-2處理后，與改善親水性后的HAC-PLA三維多孔框架復(fù)合，構(gòu)建組織工程骨。電鏡顯示接種的細(xì)胞能在此組織工程骨內(nèi)部生長增殖，術(shù)后8周C組有新骨形成，A組注射部位表面平整，無新生物，B組為纖維組織，無骨及軟骨形成。結(jié)論 所構(gòu)建的組織工程骨有望成為骨創(chuàng)傷修復(fù)治療一種新的技術(shù)。
目的 探討復(fù)合重組人骨形成蛋白2（recombinant human bone morphogenetic protein 2, rhBMP-2）的殼聚糖明膠支架的體外成骨作用。方法 將rhBMP-2與殼聚糖-明膠支架復(fù)合，按2×104/ml的密度接種成骨細(xì)胞系或成肌細(xì)胞系至rhBMP-2復(fù)合材料上，以及無rhBMP-2復(fù)合的對照材料上。A組（2T3成骨細(xì)胞接種組），其中實(shí)驗(yàn)A組：復(fù)合有rhBMP-2的材料14塊，分別于接種培養(yǎng)第3、7、14和21天各取3塊，以管家基因β-tubulin為內(nèi)參照，RT-PCR行半定量分析，測定骨鈣素基因表達(dá)水平，余2塊于第14天終止培養(yǎng)，茜素紅-S染色觀察鈣鹽沉積情況；對照A組：未復(fù)合rhBMP-2的材料5塊，接種培養(yǎng)至14 d終止，其中3塊用于測定骨鈣素基因表達(dá)，2塊測定鈣鹽沉積。B組（C2C12成肌細(xì)胞接種組），實(shí)驗(yàn)組及對照組情況、培養(yǎng)時(shí)間及檢測指標(biāo)同A組。另取接種有rhBMP-2的材料2塊接種2T3成骨細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后掃描電鏡觀察細(xì)胞與材料的黏附情況。結(jié)果 A組培養(yǎng)3 d，掃描電鏡可見成骨細(xì)胞緊密黏附于多孔材料網(wǎng)表面，生長狀態(tài)良好。實(shí)驗(yàn)A組成骨細(xì)胞中骨鈣素基因的表達(dá)為1.28±0.17，對照A組14 d為0.56±0.09，表明復(fù)合rhBMP-2可促進(jìn)材料中骨鈣素基因表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；rhBMP-2還可誘導(dǎo)不表達(dá)骨鈣素基因的C2C12成肌細(xì)胞出現(xiàn)基因表達(dá)，B組培養(yǎng)21 d，實(shí)驗(yàn)B組為0.58±0.13，對照B組為0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。茜素紅-S染色可見，A組材料網(wǎng)絡(luò)內(nèi)均有不同程度的鈣鹽沉積。接種相同的細(xì)胞時(shí)，復(fù)合有rhBMP-2的材料中有更多的鈣鹽沉積。結(jié)論 復(fù)合有rhBMP-2的殼聚糖明膠人工骨支架材料在體外具有良好的誘導(dǎo)成骨能力。
目的 探討穩(wěn)定表達(dá)人骨形成蛋白-2(hBMP-2)基因的成纖維細(xì)胞是否具有體內(nèi)誘導(dǎo)成骨能力。方法 構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3-hBMP-2，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將其導(dǎo)入NIH3T3細(xì)胞，通過G418篩選獲得陽性克隆，并繼續(xù)培養(yǎng)4周，用細(xì)胞原位雜交和免疫組織化學(xué)方法觀察hBMP-2基因在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)，并觀察了穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活性的變化，將穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的成纖維細(xì)胞植入裸鼠肌袋內(nèi)觀察其體內(nèi)誘導(dǎo)成骨作用。結(jié)果 成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA3-hBMP-2，經(jīng)細(xì)胞原位雜交和免疫組織化學(xué)證實(shí)，轉(zhuǎn)染pcDNA3-hBMP-2后的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)有大量hMP-2 mRNA的轉(zhuǎn)錄及其蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的成纖維細(xì)胞ALP活性顯著上升，植入裸鼠肌袋內(nèi)4周有大量軟骨形成。結(jié)論 穩(wěn)定表達(dá)hBMP-2的成纖維細(xì)胞具有體內(nèi)誘導(dǎo)成骨能力。
目的 探討和比較3種鈣磷陶瓷材料HA、TCP、HA/TCP復(fù)合重組人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)體內(nèi)異位成骨效果，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法 取35只3月齡Wistar大鼠，將復(fù)合rhBMP-2的3種鈣磷陶瓷材料(1∶1) 植于鼠背部肌袋內(nèi)，未復(fù)合rhBMP-2的上述3種單純陶瓷材料為對照組。術(shù)后2、4和8周取材，測定植入物堿性磷酸酶（ALP）活性，通過HE染色和計(jì)算機(jī)圖像分析進(jìn)行組織學(xué)和組織計(jì)量學(xué)觀察，比較新生骨組織的形成。結(jié)果 術(shù)后2、4周復(fù)合植入物ALP活性測定從高到低依次為HA、HA/TCP、TCP，但在相同rhBMP-2劑量下，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與相對應(yīng)單純支架材料比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；組織學(xué)和組織計(jì)量學(xué)檢測結(jié)果顯示各復(fù)合材料組均有新骨形成，成骨量隨時(shí)間推移而增加，2周時(shí)以HA/rhBMP-2成骨量較多，但3組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；8周時(shí)新骨形成以雙相陶瓷HA/TCP最佳，相關(guān)參數(shù)和圖像分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），成骨量8周較2、4周多，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；3種單純支架材料各觀察期均無骨樣組織形成。結(jié)論 雙相陶瓷材料HA/TCP是攜帶rhBMP-2的鈣磷陶瓷良好支架材料。