目的 使用基因芯片技術分析糖尿病早期大鼠視網膜血管凋亡相關基因表達概況。 方法 腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制備糖尿病大鼠模型。在血糖升高后的第6周分別處死正常組大鼠和糖尿病組大鼠各10只,提取20只眼的視網膜血管,一步法提取總RNA。使用(alpha;-32P)脫氧腺苷酸(dATP)標記樣品制作探針,與含有1176個基因的尼龍膜芯片進行雜交。使用計算機軟件對所獲結果進行相關分析。選擇3個差異表達的基因進行逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)驗證。 結果 糖尿病大鼠第6周,136個基因具有差異表達,占檢測基因總數(shù)的11.5%。其中,表現(xiàn)為上調的基因90個,占7.6%;表現(xiàn)為下調的基因46個,占3.9%。差異表達涉及多種功能的多個基因。與凋亡信號傳導通路相關的72個基因中,有15個出現(xiàn)了表達的差異。表達上調的基因包括腫瘤壞死因子(TNF)家族中Fas相關的死亡域(FADD)、TNF受體家族成員12 (TNFRSF12)、TNF受體家族成員9 (TNFRSF9)和TRAIL;Bcl-2家族的bcl-2,bcl-w,bax和 bak1以及Akt等;表達下調的基因有Fas相關因子(FAF1)。 結論 糖尿病早期大鼠視網膜血管基因表達發(fā)生了復雜的變化,特別是多個凋亡相關通路的基因在糖尿病早期就發(fā)生改變,而且多數(shù)處在通路上游。提示糖尿病視網膜病變的發(fā)生涉及多條凋亡信號傳導通路,分子生物化學水平上的變化還僅僅局限在凋亡的誘導期。 (中華眼底病雜志,2008,24:244-248)
目的 了解在視覺發(fā)育可塑期,NMDA-R1受體基因的mRNA構型與斜 視性弱視貓視皮層神經元細胞水平表達減少有關的。 方法 同胞 正常貓和斜視性弱視貓各兩對(共4只)。采用一系列地高辛核酸分子探針做貓腦片原位雜交 ,檢測NMDA-R1不同mRNA構型在視皮層的表達情況。 結果 與正常貓相比,NMDA-R1 mRNAldquo;Panrdquo;探針和R1-a,R1-b,R1-1構型探針在斜視性弱視貓視皮層的表達顯著減少,主要在第IV層。R1-3構型的表達在斜視性弱視貓視皮層比正常貓增加,主要在第V-VI層。R1-2和R1-4構型的表達在正常貓和斜視貓視皮層的差異不顯著。 結論 斜視性弱視貓視皮層NMDA-R1 mRNA特異構型的轉錄 抑制導致受體蛋白水平表達的改變。 (中華眼底病雜志,2000,16:71-138)
目的 探討線粒體DNA(mtDNA)11778、3460、14484位點突變與遺傳性視神經病(Leberprime;s hereditary optic neuropathy,Leber病)之間的關系。 方法 應用多聚酶鏈式反-單鏈構象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)檢測臨床一對可疑Leber病同卵雙生子患者及其親屬,有突變者,對突變序列進行序列測定。 結果 PCR-SSCP檢測同卵雙生子及母親11778、3460位點所在的DNA區(qū)段存在突變,14484位點所在的DNA區(qū)段均未檢出突變,將11778位點所在DNA區(qū)段克隆后測序顯示11778位點仍為CGC,但發(fā)現(xiàn)一個新的突變位點(11915Trarr;A)。 結論 Leber病發(fā)病機制為mtDNA點突變。多位點突變也被看作為Leber病的病因。11915位點可能也是多位點突變之一??捎肞CRSSCP對臨床有視神經萎縮和視神經炎可疑為Leber病患者(包括家系成員)做出遺傳性視神經病的基因診斷。 (中華眼底病雜志, 1999, 15: 223-226)
目的 克隆大鼠視網膜緩慢變性/盤膜邊緣蛋白(retinal degeneration slow/PERIPHERIN,RDS,/peripherin)基因。 方法 以SD大鼠的視網膜polyA+RNA為模版,采用RT-PCR的方法擴增一段約1555 bp的cDNA片段,并亞克隆至pBluescriptⅡKS(+)載體中,進行限制性內切酶酶切和序列分析。 結果 證實所克隆的片段是大鼠的RDS/peripherin cDNA,與Begy等報道的序列[1]相比,除3prime;端非翻譯區(qū)的第1242位的堿基Ararr;G,第1409~1411位堿基CArarr;CCA外,其它序列基本一致[1]。 結論 已獲得大鼠RDS/peripherin基因的cDNA,為研究RDS/peripherin基因的功能及在視網膜變性疾病中的作用奠定實驗基礎。 (中華眼底病雜志,1999,15:97-99)
目的;研究RB患者腫瘤及體細胞內Rb基因的存在狀態(tài)、細微結構、Rb基因突變的特征、起源與傳遞。方法;DNA分子雜交、SSCP分析、DNA序列測定。結果:108例RB腫瘤標本中80例(?4%)存在Rb基因點突變,其中44例為純合型,20例有二個獨立發(fā)生的雜合型點突變,16例只檢出一個雜合型點突變。通過對比分析RB患者腫瘤與白細胞DNA、RB患者家庭成員白細胞DNARlo基因的結構,揭示了Rb基因點突變的起源與遺傳特征。結論:Rb基因是與RB腫瘤形成關系最為密切的基因。RB腫瘤發(fā)生需二次突變事件導致Rb基因的二個等位基因失活,第一次突變事件突出表現(xiàn)為點突變;第二次突變事件主要是LOH,其次是點突變。(中華眼底病雜志,1997,13:12-16)
目的構建pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體,為研究TFPI-2基因的功能做準備。 方法從胎盤組織中提取總RNA,逆轉錄合成cDNA,再以PCR法進行擴增。將擴增的TFPI-2基因片段克隆到pEGFP-N3真核表達載體上,經XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后,行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,同時測定其DNA序列。將pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體以脂質體LipofectamineTM 2000介導的方法轉染Top10感受態(tài)細胞(轉染組),同時設空白對照組(僅轉染pEGFP-N3質粒)和未轉染組(不予轉染)。采用Western blot法檢測3組細胞中TFPI-2蛋白的表達情況。 結果總RNA經分光光度法驗證,其純度符合PCR法擴增的要求。構建的pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體經XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后,行1%瓊脂糖凝膠電泳,結果顯示,分別在708 bp處和4 700 bp處有特異擴增條帶,大小與理論值一致。DNA序列測定結果證實,pEFFP-N3-TFPI-2真核表達載體的序列完全正確。Western blot法結果顯示,TFPI-2蛋白的表達量轉染組為0.657 3±0.032 5,空白對照組為0.301 7±0.028 7,未轉染組為0.314 3±0.026 6,轉染組TFPI-2蛋白的表達量高于空白對照組和未轉染組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 結論本實驗成功構建了pEGFP-N3-TFPI-2真核表達載體,為TFPI-2基因功能的研究奠定了基礎。
目的明確一國人低外顯率視網膜母細胞瘤(RB)家系基因突變位點。 方法對一個3代9人的漢族RB家系成員進行臨床觀察。采集家系中6人外周靜脈血并提取基因組DNA。運用外顯子結合目標區(qū)域捕獲測序芯片進行檢測; 對候選致病性突變位點運用Sanger驗證, 確定致病性突變位點。 結果家系9人中, 先證者(Ⅲ2)為雙眼RB, Ⅲ1為單眼RB; Ⅲ3為雙眼RB, 已死亡。除先證者外, Ⅲ1左眼及其他所有受試者眼底檢查結果正常?;驒z測結果顯示, RB患兒及2名攜帶者(Ⅱ2、Ⅱ3)Rb1基因檢出一個錯義突變c.1981C>T (p.Arg661Trp); 2名正常者(Ⅱ1、Ⅱ4)未發(fā)現(xiàn)該突變。推測該家系RB外顯率為50%。 結論國人一RB低外顯率家系中發(fā)現(xiàn)Rb1基因錯義突變c.1981C>T; RB外顯率為50%。
目的觀察寧夏地區(qū)散發(fā)型視網膜色素變性(RP)的致病基因及其遺傳方式。 方法臨床檢查確診為散發(fā)型RP(sRP)的患者49例以及家庭成員128名納入研究。詳細收集患者病史、家族史;患者以及家庭成員均行最佳矯正視力、裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡、眼底彩色照相、視野、光相干斷層掃描、全視野視網膜電圖檢查;采集患者及其家庭成員外周靜脈血,提取全基因組DNA。采用外顯子捕獲技術對目前已知的230個視網膜疾病致病基因進行相關基因排查,確定候選致病基因突變位點;第二代測序技術直接測序法進行驗證,并在家庭成員中進行共分離,分析其遺傳方式。 結果49例sRP患者中,24例患者檢測出致病基因16個,檢測陽性率為49.0%;發(fā)現(xiàn)突變位點41個。其中,新發(fā)現(xiàn)突變位點32個,占78.0%。24例檢測出致病基因的患者中,致病基因USH2A 7例,占29.2%;C2orf71、RDH12、CNGA1各2例,分別占8.3%;RPGR1、IFT140、TULP1、CLRN1、RPE65、ABCA4、GUCA1A、EYS、CYP4V2、GPR98、ATXN7各1例,分別占4.2%。根據(jù)其家庭成員基因篩查結果分析,24例檢測出致病基因的患者中,隱性遺傳RP 20例,占83.3%;顯性遺傳RP 3例,占12.5%;X連鎖遺傳RP 1例,占4.2%。USH2A基因突變的7例患者中3例確診為Usher綜合征。 結論寧廈地區(qū)sRP患者主要致病基因為USH2A基因;檢測出致病基因的患者中83.3%為常染色體隱性遺傳RP。
目的研究1個常染色體顯性遺傳家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)家系的致病基因突變。 方法一個3代常染色體顯性遺傳FEVR家系中3例患者及1例患者的配偶納入研究。先證者,男,5歲。其母親和外公眼底均表現(xiàn)為典型的FEVR改變;父親眼底檢查正常。采集所有受試者外周靜脈血,提取基因組DNA,擴增候選致病基因Norrie病、卷曲蛋白4(FZD4)、低密度脂蛋白受體相關蛋白5、四旋蛋白12、鋅指蛋白408基因的全部編碼區(qū)及外顯子-內含子交界區(qū)剪切位點附近的序列,直接測序法檢測潛在致病基因突變。應用分析軟件明確該基因突變位點的保守性、有害性及可能引起的蛋白結構改變。 結果3例患者及先證者父親共檢測到5個單核苷酸變異,濾過最小等位基因頻率值高于0.001的高頻變異位點4個,可疑致病突變位點1個即FZD4基因c.478G>A。該突變位點所對應的氨基酸改變?yōu)镕ZD4基因所編碼蛋白的第160號氨基酸從谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔╬.E160K)?;蛐秃捅硇凸卜蛛x驗證結果表明,F(xiàn)ZD4 p.E160K為該家系的致病突變位點。蛋白序列同源性分析結果顯示,該突變位點在多個物種中均高度保守;功能性分析結果顯示,該突變?yōu)橛泻π酝蛔?;晶體結構分析結果顯示,該突變能夠引起第160號氨基酸位點與第152號天冬酰胺間的氫鍵消失,影響蛋白的三級結構和正常功能。 結論發(fā)現(xiàn)并證實了該家系FZD4 p.E160K為FEVR的新突變位點。